響應(yīng)曲面法優(yōu)化山楂表兒茶素提取工藝

蔡向杰 屈云萍 楊斯斯 馮玉康 王文鵬 姜國志

1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，石家莊 051430；2.中藥注射劑新藥技術(shù)開發(fā)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，石家莊 051430

山楂為薔薇科落葉灌木或小喬木山楂（Crataegus pinnatifida Bge.var.major.N.E.Br.）山里紅及野山楂（Crataegus cuneata Sieb.et Zucc.）的干燥成熟果實(shí)[1]，前兩種習(xí)稱“北山楂”，后一種習(xí)稱“南山楂”。山楂性酸、甘，味溫，歸脾、胃、肝經(jīng)，具有消食化積、活血化瘀的功效，主治食滯不化及產(chǎn)后淤阻腹痛[2-3]。山楂主要含總黃酮、表兒茶素和膳食纖維素。其中，表兒茶素類多酚物質(zhì)具有抗癌活性[4-6]，還有很強(qiáng)的抗氧化作用，可有效清除自由基、預(yù)防脂質(zhì)過氧化引起的動脈硬化和血栓形成，臨床試驗(yàn)證明其療效顯著且安全無毒副作用[7-11]。目前對表兒茶素提取工藝的相關(guān)研究甚少，因此，本研究采用響應(yīng)曲面法，優(yōu)化山楂表兒茶素提取工藝參數(shù)，為山楂表兒茶素的開發(fā)提供參考。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

山楂藥材購于平邑縣原田金銀花專業(yè)合作社，經(jīng)河北省藥品檢驗(yàn)研究院孫寶惠老師檢驗(yàn)鑒定為北山楂（Crataegus pinnatifida Bge）的干燥果實(shí)。表兒茶素對照品（批號：878-200102）購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用。甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮均為分析純。

1.2 儀器

METTLER-ALC-210.4 電子分析天平（上海梅特勒托利多儀器有限公司）；Ultimate 3000 高效液相色譜儀（美國戴安公司）；HH-SB型電熱恒溫水浴鍋（科偉儀器）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 山楂提取工藝

取200 g 山楂，加入10 倍量一定濃度的有機(jī)溶劑加熱回流提取3次，過200 目濾布合并上清液，回收溶劑，濃縮為干膏粉。

2.2 山楂表兒茶素含量測定方法

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[12-15]色譜柱：Diamonsil C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）；流動相：0.04 mol/L 枸櫞酸∶N，N-二甲基甲酰胺∶四氫呋喃（45∶8∶2，v/v/v）；檢測波長：280 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 ml/min。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取表兒茶素對照品加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.4 mg/ml 的對照品溶液。

2.2.3 樣品溶液的制備 取本品細(xì)粉0.25 g，精密稱定，置50 ml 三角瓶中，加入甲醇-水（1∶1）10.0 ml，精密稱定。超聲（220 V，50 W）提取30 min，放冷，精密稱定重量，加甲醇-水（1∶1）補(bǔ)足減失重量，搖勻，用濾紙濾過，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5 μl，注入液相色譜儀測定。

2.3 山楂表兒茶素純品質(zhì)量

山楂表兒茶素純品質(zhì)量=干膏粉質(zhì)量×含量

2.4 提取試劑的選擇

表兒茶素為黃酮類化合物，其母核上連有5 個(gè)酚羥基，在強(qiáng)極性溶劑中溶解度很好，故采用極性溶劑進(jìn)行提取[16]。

取200 g 山楂，分別用10 倍量（v/m）甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮按照2.1 工藝流程提取，比較4 種有機(jī)溶劑對表兒茶素的提取效果。結(jié)果顯示，乙醇提取效果最好，表兒茶素純品質(zhì)量為13.2267 mg，甲醇次之，丙酮最差（圖1）。故選乙醇為提取試劑。

圖1 不同溶劑對山楂表兒茶素含量的影響圖

2.5 單因素考察

試驗(yàn)按照表1 進(jìn)行。

表1 單因素考察試驗(yàn)方案

2.6 響應(yīng)曲面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 的中心組合設(shè)計(jì)原理[17-18]，設(shè)計(jì)自變量，以表兒茶素純品質(zhì)量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)曲面分析（response surface analysis，RSA）[19]進(jìn)行山楂提取工藝條件的優(yōu)化。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

將優(yōu)化得到的最佳使用條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，3次驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果與模型預(yù)期結(jié)果比較，計(jì)算與模型給出理論值的相對偏差，用于評判模型的擬合程度。

2.8 單因素試驗(yàn)結(jié)果

單因素試驗(yàn)對山楂表兒茶素純品質(zhì)量的影響趨勢如圖2 所示。

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果圖

2.8.1 乙醇濃度對山楂表兒茶素純品質(zhì)量的影響 由圖2A 可以看出，乙醇濃度為30%時(shí)表兒茶素純品質(zhì)量最高。隨著乙醇濃度的升高，純品質(zhì)量反而減少，可能是乙醇濃度過高抑制了有效成分的溶出，綜上兩個(gè)原因?qū)е伦罱K純品質(zhì)量減少[20]。

2.8.2 提取時(shí)間對山楂表兒茶素純品質(zhì)量的影響 由圖2B 可以看出，當(dāng)提取時(shí)間＜3 h 時(shí)，山楂表兒茶素純品質(zhì)量隨提取時(shí)間延長而增加；當(dāng)提取時(shí)間為3 h時(shí)表兒茶素純品質(zhì)量最高，隨時(shí)間延長純品質(zhì)量減少，可能是因?yàn)闀r(shí)間過長，破壞了提取平衡，表兒茶素發(fā)生降解。因此，綜合考慮提取時(shí)間選為3 h。

2.8.3 提取溫度對山楂表兒茶素含量的影響 由圖2C可以看出，60℃時(shí)表兒茶素的提取率達(dá)到最高；隨著溫度繼續(xù)升高，山楂表兒茶素的提取率降低，可能兒茶類化合物在加熱條件下不穩(wěn)定[21]會發(fā)生降解、氧化、縮合等化學(xué)反應(yīng)。

2.8.4 提取次數(shù)對山楂表兒茶素含量的影響 由圖2D可以看出，提取次數(shù)為3次時(shí)出現(xiàn)含量最高值，但隨著次數(shù)繼續(xù)增加純品質(zhì)量不再發(fā)生變化，可能是已經(jīng)將有效成分提取完全。

2.9 提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

2.9.1 因素選擇 選取乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）、提取次數(shù)（D）為山楂表兒茶素含量影響顯著的4 個(gè)因素，用Y 表示表兒茶素的純品含量，采用4 因素3 水平的RSA 法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平選擇見表2。

表2 中心組合試驗(yàn)因素和水平

2.9.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn) 采用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表3。

2.10 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

采用Design-Expert 8.0.6 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到山楂表兒茶素的含量與各因素變量的二次方程模型：Y=14.90+0.94A-0.023B-0.25C+0.33D+0.20AB-0.049AC-0.61AD+0.085BC+0.56BD+0.11CD-0.93A2-0.60B2-0.73C2-0.46D2

對該模型進(jìn)行方差分析，得出回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果（表4）。

表4 響應(yīng)曲面二次回歸方程方差分析

由表4 分析結(jié)果可知，擬合程度較好，試驗(yàn)所選模型極其顯著，試驗(yàn)誤差較小，因此可用此模型預(yù)測提取山楂表兒茶素的提取結(jié)果。

模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，模型的一次項(xiàng)A、C、D 達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其中D 對表兒茶素含量的線性效應(yīng)顯著（P＜0.01），二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2達(dá)到顯著水平（P＜0.05），交互項(xiàng)AD 和BD 都達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），交互作用顯著，與曲面圖相吻合（圖3）。由此可知，A（乙醇濃度）、C（提取溫度）、D（提取次數(shù)）是對山楂表兒茶素提取的線性效應(yīng)和曲面效應(yīng)都極其顯著的因素，其中提取次數(shù)和乙醇濃度及提取次數(shù)和提取時(shí)間都分別有交互作用。

2.11 響應(yīng)曲面分析

曲面模型模擬出的等高線和曲面圖顯示，AC、BC和CD 的等高線和曲面圖AB 相似，等高線為圓形，表示交互效應(yīng)較弱，與響應(yīng)曲面二次回歸方程方差分析表中的結(jié)果相吻合。AB、AC、BC、CD 的P 值均＞0.05，屬于交互作用不明顯（圖4）。

以上分析表明，諸因素對結(jié)果影響程度為A（乙醇濃度）＞D（提取次數(shù)）＞C（提取溫度）＞B（提取時(shí)間）。

圖3 Y=f（A，D）的響應(yīng)曲面和等高線圖

圖4 Y=f（B，C）的響應(yīng)曲面和等高線圖

2.12 響應(yīng)曲面優(yōu)化山楂表兒茶素提取工藝條件

采用Design-Expert 8.0.6 軟件，預(yù)測的山楂表兒茶素提取最佳工藝為：乙醇濃度40%，提取溫度58.83℃，提取次數(shù)2.64次，提取時(shí)間2.98 h，由此得出山楂表兒茶素純品質(zhì)量高達(dá)14.9861 mg。為方便操作和技術(shù)方便，將提取工藝參數(shù)調(diào)整為：乙醇濃度40%，提取溫度60℃，提取次數(shù)3次，提取時(shí)間2.5 h，并重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，山楂表兒茶素的純品質(zhì)量經(jīng)計(jì)算分別為14.78 mg，14.82 mg 和14.88 mg，平均值為14.83 mg，RSD=0.3%。結(jié)果表明，基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化提取條件準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

本研究通過響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法考察了乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)4 個(gè)因素對山楂表兒茶素純品含量的影響，建立的數(shù)學(xué)模型顯著有效，且得到了各因素的最佳值：乙醇濃度為40%，提取溫度為60℃，提取次數(shù)為3次，提取時(shí)間為2.5 h。通過3次驗(yàn)證結(jié)果表明，200 g 山楂中表兒茶素純品質(zhì)量可達(dá)14.83 mg。本試驗(yàn)為山楂表兒茶素提取工藝提供了技術(shù)支持。

傳統(tǒng)的提取工藝優(yōu)化通常采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)相比，響應(yīng)曲面法雖試驗(yàn)次數(shù)相對較多，但其能將因素與響應(yīng)值的相互關(guān)系函數(shù)化，建立連續(xù)變量曲面模型，考察的因素不僅僅局限于所設(shè)計(jì)的水平，比正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)更直觀、精確地得到最優(yōu)組合條件，由此得到更高的總酚酸提取率。因此，該優(yōu)化提取方法可在山楂表兒茶素提取工藝研究及生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

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