糖絡寧對STZ誘導糖尿病大鼠背根神經節線粒體抗氧化劑活性的影響

張濤靜，龔燕冰，周暉，謝培鳳，關崧，易文明

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糖絡寧對STZ誘導糖尿病大鼠背根神經節線粒體抗氧化劑活性的影響

張濤靜，龔燕冰，周暉，謝培鳳，關崧，易文明

目的 觀察中藥復方糖絡寧對糖尿病大鼠背根神經節細胞線粒體中3種抗氧化劑的影響。方法SD雄性大鼠40只，隨機取7只為對照組，余33只制作鏈脲佐菌素糖尿病大鼠模型，其中29只造模成功后隨機分為模型組9只、治療組10只、中藥組10只，分別給予生理鹽水、α硫辛酸和糖絡寧灌胃，共給藥8周，觀察各組大鼠背根神經節細胞線粒體錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、過氧化氫酶(CAT)活性的變化。結果 與對照組比較, 模型組大鼠線粒體MnSOD、GPX、CAT活性(U/mg蛋白)均明顯下降(分別為32.16±4.75vs. 20.17±3.31,45.67±5.64vs. 30.19±4.33,2.87±0.47vs. 1.24±0.34，P<0.01)；與模型組比較，治療組、中藥組大鼠線粒體MnSOD、GPX、CAT的活性均明顯改善(分別為30.78±5.27、39.10±7.67、2.56±0.31和29.14±3.79、39.43±6.23、2.49±0.28，P均<0.01)。結論 糖絡寧可顯著提高糖尿病大鼠背根神經節線粒體中3種抗氧化劑的活性，可能是其防治糖尿病周圍神經病變的機制。

糖絡寧；糖尿病；線粒體；抗氧化劑；大鼠

【DOI】 10.3969 /j.issn.1671-6450.2015.02.022

糖尿病性周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常見慢性并發癥之一，也是糖尿病患者致殘的主要原因，嚴重影響了糖尿病患者的生存質量，其發病率與病程有關[1，2]。目前研究證實氧化應激是DPN最核心和關鍵的發病機制，其中線粒體氧化應激在DPN發病中顯得尤為重要。而引起線粒體氧化應激的一個重要因素是線粒體中抗氧化劑錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、過氧化氫酶(CAT)等活性大幅度下降。中藥復方制劑糖絡寧治療DPN有較好療效，但具體作用機制不明，本實驗復制DPN大鼠模型，觀察糖絡寧對鏈脲佐菌素(STZ)誘導DPN大鼠背根神經節細胞線粒體抗氧化劑活性的影響，從而探討其治療糖尿病周圍神經病變的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：清潔級雄性8周齡SD大鼠，體質量200～250 g，合格證號：SCXK(京)2012-0001，由北京維通利華實驗動物技術有限公司供給。實驗前大鼠適應性喂養2周。實驗室條件：GB14925-2001規定動物實驗設施大鼠清潔級屏障環境[環境安全合格證號：SYXK(京)2011-0024],室內相對溫度(25±1)℃,相對濕度(60±10)%。(2)試劑：STZ(美國Merck公司，批號B69776)，以下試劑盒由南京建成生物工程研究所提供：CAT、MnSOD、GPX原位檢測試劑盒。α硫辛酸(a-lipoic acid)(批號82159-09-9)。氯化鉀、甘露醇、蔗糖、EDTA、TRIS-HCl、磷酸氫二鉀、琥珀酸、疊氮鈉、吡啶等均為國藥集團化學試劑北京有限公司生產分析純。(3)儀器：YQ-3型電動勻漿機(無錫沃信儀器有限公司)；5417R型臺式高速低溫離心機(德國Eppendorf公司)；CP224C精密電子天平(美國奧豪斯公司)；UV754N型紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；RF-5301PC熒光分光光度計(日本日本島津公司)；XK95-B型漩渦混合器(江蘇姜堰市康泰醫療器材廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模及分組： SD雄性大鼠40只，造模前隨機選擇7只為對照組，其余大鼠予STZ 60 mg/kg腹腔注射，72 h后測血糖≥16.7 mmol/L為造模成功，將成模大鼠29只隨機分為治療組10只、中藥組10只、模型組9只。

1.2.2 給藥方法： 中藥組給予糖絡寧制劑(為東方醫院制劑室自制，約為生藥10 g/ml，方藥組成：丹參、全蝎、生黃芪、牛膝、狗脊等)按生藥5 g·kg-1·d-1灌胃，換算成糖絡寧為0.5 ml灌胃；治療組按20 mg/kg·d灌胃，使用時將α硫辛酸用蒸餾水配成混懸液(2.5 mg/ml)灌胃；模型組及對照組予等量生理鹽水灌胃，實驗期間自由飲食，連續給藥8周。

2 結 果

與對照組比較, 模型組大鼠線粒體MnSOD、GPX、CAT活性均明顯下降(q值28.31、29.14、26.13P<0.01)；與模型組比較，治療組、中藥組大鼠線粒體MnSOD、GPX、CAT活性均明顯改善(q值分別為27.16、28.16、25.24和26.78、28.34、24.87，P均<0.01)；治療組與中藥組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠8周后背根神經節線粒體MnSOD、GPX及CAT活性比較蛋白)

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較,bP<0.01

3 討 論

STZ造模形成的DPN大鼠模型，其實是1型糖尿病大鼠模型，但經過我們多年的實驗研究，證實此種造模方式，造模成功率高，動物病死率低，神經損害較為嚴重，是比較適合的DPN大鼠模型。

DPN是糖尿病最為常見的慢性并發癥,常表現為對稱性遠端多神經病變,以下肢對稱性麻木發涼為主要表現，是導致糖尿病患者生活質量下降甚至致殘的原因之一。DPN的發病機制至今尚未完全闡明，近年來的證據表明氧化應激(oxidativestress)，尤其是線粒體氧化應激在DPN的發生發展過程中起著至關重要的作用。線粒體(mitochondria)作為神經細胞中最主要的產能及氧化細胞器，其內存在多種抗氧化劑，其中以MnSOD、GPX、CAT三者最為重要。正常情況下三大抗氧化劑的存在能保障活性氧簇(ROS)處于一個正常水平，其中MnSOD可還原O2-為H2O2，GPX、過氧化氫酶可將H2O2還原為H2O，高血糖下不僅上述抗氧化劑水平下降，其表達也受到抑制[7，8]，引起線粒體內抗氧化水平下降，ROS大量產生。 我們的研究也證實了這一點，實驗中模型組大鼠背根神經節線粒體中所有抗氧化劑的活性較對照組均顯著下降，提示神經細胞內線粒體中抗氧化劑活性下降與DPN的發生密切相關。而使用抗氧化劑α硫辛酸后線粒體中各抗氧化劑的活性都得到一定程度恢復，這可能是α硫辛酸治療DPN、抗氧化作用的機制之一。DPN中醫病名為“消渴病痹痿”，我們認為其基本病機為本虛標實，本虛為肝腎不足，標實為瘀血阻絡，治法為滋補肝腎、活血通絡，糖絡寧方中牛膝、狗脊滋補肝腎，丹參、全蝎活血通絡，共同發揮作用。糖絡寧的臨床療效已得到多項研究證實[9～12]，機制研究也證實糖絡寧可降低糖尿病大鼠坐骨神經山梨醇水平[13]，升高糖尿病大鼠血清神經生長因子(NGF)含量和坐骨神經NGFmRNA表達[14]，升高血清中IGF-I的含量，上調糖尿病大鼠肝組織IGF-ImRNA表達[15]。后續的一些研究還證實糖絡寧可提高糖尿病大鼠背根神經節中線粒體呼吸鏈各個復合物的活性[4]，不過這只是間接減少線粒體氧化應激。本研究則檢測與線粒體氧化應激直接相關的抗氧化劑活性，并證實糖絡寧可顯著改善糖尿病大鼠背根神經節線粒體抗氧化劑的活性，從而直接提供了糖絡寧減少線粒體氧化應激的證據，這可能是其防治DPN的機制之一。

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8BuggerH,BoudinaS,HuXX,etal.Type1diabeticakitamouseheartsareinsulinsensitivebutmanifeststructurallyabnormalmitochondriathatremaincoupleddespiteincreaseduncouplingprotein3[J].Diabetes,2008,57(11):2924-2932.

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12 林洪彬，李作武.脈絡寧口服液治療2型糖尿病合并視網膜病變的臨床研究[J].中國醫藥導報，2010，7(17)：35-36.

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Effect of Tangluoning on activities of mitochondrial antioxidants in dorsal root ganglion in STZ induced diabetic rats

ZHANGTaojing,GONGYanbin,ZHOUHui,XIEPeifeng,GUANSong,YIWenming.

DepartmentofEndocrinology,DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China

Objective To observe the effect of Chinese herbal compoundTangluoningon3kindsofantioxidantsmitochondrialdorsalrootganglioncellsindiabeticrats.Methods There were 40 SD male rats, 7 of them were randomly selected as the control group, the rest 33 were used to establish the streptozotocin (STZ) diabetic rat model, 29 rats of the model were randomly divided into model group with 9 rats, treatment group with 10 rats, Chinese medicine group with 10 rats, they were given saline, alpha lipoic acid andTangluoningrespectively,theywasgiventhemedicinefor8weeks,mitochondriaofratmanganesesuperoxidedismutase(MnSOD),glutathioneperoxidase(GPX),catalase(CAT)activitychangesofthedorsalrootganglioncellswereobserved.Results Compared with the control group, the model group rats’ mitochondrial MnSOD, GPX, the activity of CAT (U/mg protein) decreased significantly (32.16±4.75 vs. 20.17±3.31, 45.67±5.64 vs. 30.19±4.33, 2.87±0.47 vs. 1.24±0.34,P<0.01);comparedwiththemodelgroup,treatmentgroupandthetraditionalhinesemedicinegroup’smitochondrialMnSOD,GPX,theactivityofCATweresignificantlyimproved(30.78±5.27, 39.10±7.67, 2.56±0.31, 29.14±3.79, 39.43±6.23, 2.49±0.28,respectively,P<0.01). Conclusion It proved that theTangluoningwouldsignificantlyimprovethe3kindsofantioxidantactivityindorsalrootganglionmitochondriaofdiabeticrats,whichmaybethemechanismofTangluoningforpreventionandtreatmentofdiabeticperipheralneuropathy.

Tangluoning;Diabetesmellitus;Mitochondria;Antioxidant；Rats

國家自然科學基金青年基金項目(No.81102574)；國家自然科學基金面上項目(No.81473663)；北京中醫藥大學 臨床自主創新課題(No.2011JYBZZJSY-087)

100078 北京中醫藥大學東方醫院內分泌科

2014-11-04)