N-乙酰半胱氨酸在緩解氧化應激造成的血管平滑肌細胞損傷和表型轉變中的作用

樊明強，張延林，丁　濤，王　瑩

(平涼市人民醫院心內科，甘肅 平涼 744000)

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N-乙酰半胱氨酸在緩解氧化應激造成的血管平滑肌細胞損傷和表型轉變中的作用

樊明強※，張延林，丁濤，王瑩

(平涼市人民醫院心內科，甘肅 平涼 744000)

摘要：目的研究N-乙酰半胱氨酸(NAC)在緩解氧化應激誘導血管平滑肌細胞(VSMC)損傷和表型轉變中的作用。方法小鼠VSMC(MOVA細胞)常規培養后隨機分為4組:對照組、35 μmol/L叔丁基氫過氧化物(t-BHP)處理組、35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC處理組、1 mmol/L NAC處理組。二氯熒光黃二乙酸酯探針檢測t-BHP處理后的細胞內活性氧類(ROS)水平。CCK-8試劑盒法檢測各組細胞的抑制率，實時熒光定量聚合酶鏈反應技術與Western blot檢測血管平滑肌合成型標志物α-肌動蛋白(SMA)和合成型標志物平滑肌胚胎型肌球蛋白重鏈(SMemb)的mRNA和蛋白表達，同時分析NAC和t-BHP 處理對miR-145表達的影響。結果35 μmol/L t-BHP處理后，細胞內ROS水平顯著增高，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。與35 μmol/L t-BHP處理組相比，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC處理組細胞內的ROS水平降低(P<0.05)。與對照組相比，35 μmol/L t-BHP處理后細胞抑制率、凋亡率增高，差異有統計學意義(P<0.05)。與35 μmol/L t-BHP 處理組相比，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC處理組細胞抑制率和凋亡率均降低(P<0.05)。與對照組相比，35 μmol/L t-BHP處理后細胞SMA表達降低，SMemb表達增高，差異有統計學意義(P<0.05)。與35 μmol/L t-BHP處理組相比，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC處理組SMA表達較高，SMemb表達較低(P<0.05)。與對照組相比，35 μmol/L t-BHP處理后miR-145的表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與35 μmol/L t-BHP處理組相比，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC處理組miR-145的表達增加(P<0.05)。結論NAC可以緩解氧化應激誘導的VSMC損傷和表型轉變，此過程中伴隨miR-145的表達增高。

關鍵詞：N-乙酰半胱氨酸；血管平滑肌細胞；氧化應激；微RNA

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是一種血管內壁脂質異常沉積造成的血管硬化[1]。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖和表型轉變的異常在As的發生中扮演重要角色，VSMC的增殖/凋亡平衡失調會誘發不穩定斑塊的形成[2]。氧化應激過程中增高的活性氧類(reactive oxidative species，ROS)水平是造成VSMC損傷的確定因素，能引起VSMC凋亡等細胞損傷[3]，但是氧化應激能否引起VSMC的表型轉變還少有報道。有研究發現，microRNA-145(miR-145)可以抑制VSMC由收縮型轉為合成型[4]，因此本研究采用叔丁基氫過氧化物(tert-butyl hydroperoxide，t-BHP)誘導小鼠VSMC(MOVA 細胞株)的氧化應激狀態，觀察MOVA細胞的增殖變化，通過檢測VSMC收縮型標志物平滑肌α-肌動蛋白(smooth muscle actin，SMA)與合成型標志物平滑肌胚胎型肌球蛋白重鏈(smooth muscle embryonic myosin heavy chain，SMemb)的表達變化，研究氧化應激對MOVAS細胞表型轉變的影響，并使用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylglucosamine，NAC)進行保護處理，探討NAC能否緩解氧化應激造成的VSMC損傷及表型改變，并分析miR-145在NAC處理后的表達變化。

1材料與方法

1.1主要試劑與儀器NAC、t-BHP、膜聯蛋白-碘化丙啶凋亡檢測試劑盒及二氯熒光黃二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescindiacetate，DCFH-DA)熒光探針購自美國Sigma公司。CCK-8(Cell Counting 8)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。DMEM培養基、胎牛血清購自賽默飛世爾生物化學制品有限公司。RNA提取試劑盒購自美國QIAGEN公司，ImProm-Ⅱ?反轉錄試劑盒和GO Taq?qPCR Master Mix購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司。放射免疫分析蛋白裂解液、雙喹啉-4-羧酸二鈉鹽蛋白定量分析盒、電化學發光顯色試劑盒顯色購自北京普利萊生物技術公司。兔抗小鼠SMA多克隆抗體、兔抗小鼠SMemb多克隆抗體、兔抗小鼠β-actin多克隆抗體及HRP標記山羊抗兔IgG二抗購自美國SANTA CRUZ公司。儀器：流式細胞儀(FACSCalibur,美國BD公司)、酶聯免疫檢測儀(HBS-1096B，南京德鐵設備有限公司)、熒光分光光度計(F97，上海精密儀器儀表有限公司)。

1.2小鼠平滑肌細胞的培養小鼠平滑肌細胞株MOVAS購自北京中原公司，使用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養于37 ℃、5% CO2常規條件下。

1.3細胞分組MOVAS細胞分為4組:對照組，不接受任何藥物處理；35 μmol/L t-BHP組采用35 μmol/L t-BHP以誘導氧化應激；35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC組，在t-BHP處理細胞的同時加入1 mmol/L NAC；1 mmol/L NAC組，僅使用1 mmol/L NAC處理細胞。處理時間均為24 h。

1.4DCFH-DA探針檢測各組細胞內的ROS水平各組細胞完成處理后，加入含10 μmol/L DCFH-DA探針的無血清DMEM培養基，避光37 ℃ 孵育0.5 h。調整細胞濃度為1×105/mL，熒光分光光度計檢測細胞內熒光水平，激發波長設為485 nm 發射波長設為533 nm。ROS水平以熒光強度表示。

1.5CCK-8法計算各組細胞的存活率各組細胞完成處理后，每孔加入10 μL CCK試劑，繼續培養4 h。搖床震蕩10 min。 酶標儀分析各組450 nm處的吸光度，計算公式：細胞抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%，計算各組細胞抑制率。

1.6實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測各組細胞SMA、SMemb及miR-145 的mRNA 表達細胞處理后，使用ImProm-Ⅱ?反轉錄試劑盒對提取出的RNA進行反轉錄，以合成cDNA。反轉錄體系參照試劑盒提供的說明書。使用GO Taq?qPCR Master Mix試劑盒對上述合成的cDNA進行PCR擴增。SMA的上游引物序列為5′CCTATCTATGAGGGCTATGCC 3′,下游引物序列為5′TTCGTAGCTCTTCTCCAGGGA3′；SMemb引物上游序列為5′AGAGAGACCTGCCAATCCC 3′,下游引物序列為5′TTCCAAAGCTCAGCCACAAA 3′；β-actin的上游引物為5′TGCTGT CCCTGTATGCCTCT3′,下游引物為5′TTGATGTCACGCACGATTTC3′。miR-145上游引物序列為5′ATTATATTGTCCAGTTTTCCCAGG 3′，下游引物序列為5′AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCTC 3′；miRNA-145的檢測使用U6 snRNA為內參，其上游引物為5′ATTGGAACGATACAGAGAAGATT3 ′，下游引物為5′GGAACGCTTCACGAATTTG3′。反應體系和方案參照試劑盒說明書。使用2-△△CT法分析各樣本的相對表達情況。

1.7Western blot 檢測各組細胞SMA、SMemb的蛋白表達各組細胞處理后，使用含1%蛋白抑制劑的放射免疫分析裂解液裂解細胞，提取蛋白。蛋白提取液與上樣緩沖液混勻后煮沸5 min，每孔上樣量均為40 μg。12%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，電泳完成后，用聚偏二氟乙烯膜電轉條帶。5%脫脂奶粉室溫封閉膜1 h。分別使用兔抗小鼠β-actin多克隆抗體、兔抗小鼠SMA多克隆抗體、兔抗小鼠SMemb多克隆抗體4 ℃結合過夜。電化學發光顯色試劑盒顯色，分析蛋白條帶。

2結果

2.1各組細胞經過處理后的ROS水平變化4組間ROS水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。組間兩兩比較結果顯示，35 μmol/L t-BHP組和35 μmol/L t-BHP+1mmol/L NAC組熒光強度高于對照組(P<0.05)，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC組和1 mmol/L NAC組熒光強度低于35 μmol/L t-BHP組(P<0.05)，與1 mmol/L NAC組相比，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC組熒光強度較高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2NAC和t-BHP處理對MOVA細胞增殖率的影響4組間MOVA細胞增殖率比較差異有統計學意義(P<0.05)。組間兩兩比較結果顯示，35 μmol/L t-BHP組和35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC組細胞增殖率高于對照組(P<0.05)，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC組和1 mmol/L NAC組細胞增殖率低于35 μmol/L t-BHP組(P<0.05)，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC組細胞增殖率低于1 mmol/L NAC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3NAC和t-BHP處理對MOVA細胞表型的影響各組間SMA的mRNA和SMemb的mRNA表達比較差異有統計學意義(P<0.05)。組間兩兩比較結果顯示，35 μmol/L t-BHP組和35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC組SMA的mRNA、SMemb的mRNA表達水平高于對照組(P<0.05)，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC組和1 mmol/L NAC組SMA的mRNA、SMemb的mRNA表達水平低于35 μmol/L t-BHP組(P<0.05)，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC組和1 mmol/L NAC組比較，SMA的mRNA表達較低，Smemb的mRNA表達較高，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。Western blot 分析各組SMA、SMemb的蛋白表達結果與mRNA表達結果一致，35 μmol/L t-BHP組和35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC組SMA的mRNA、SMemb的蛋白表達水平高于對照組，1 mmol/L NAC組與對照組比較，SMA及Smemb 蛋白表達強度類似,35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC組和1 mmol/L NAC組SMA及SMemb的蛋白表達水平低于35 μmol/L t-BHP組，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC組和1 mmol/L NAC組比較，SMA的蛋白表達較低，Smemb的蛋白表達較高，見圖1。

圖1　各組細胞SMA和Smemb的蛋白表達條帶　SMA：平滑肌α-肌動蛋白；SMemb:平滑肌胚胎型肌球蛋白重鏈

2.4NAC和t-BHP處理會對MOVA細胞miR-145表達的影響各組間miR-145的表達比較差異有統計學意義(P<0.05)。35 μmol/L t-BHP組和35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC組miR-145表達低于對照組，1 mmol/L NAC組miR-145表達高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC組和1 mmol/L NAC組miR-145表達高于35 μmol/L t-BHP組(P<0.05)，35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC組和1 mmol/L NAC組比較，miR-145明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1NAC和t-BHP處理對ROS及MOVA細胞增殖率、細胞表型及miR-145表達的影響

組 別ROS水平MOVA增殖抑制(%)SMAmRNA表達SMembmRNA表達miR-145表達對照組30±30.0±0.01.00±0.011.00±0.011.00±0.0135μmol/Lt-BHP組60±4a53.6±5.6a0.61±0.03a1.59±0.02a0.55±0.03a35μmol/Lt-BHP+1mmol/LNAC組46±4ab30.2±3.9ab0.75±0.02ab1.32±0.01ab0.79±0.04ab1mmol/LNAC組33±5bc5.6±0.3bc0.92±0.02bc0.95±0.02bc1.41±0.02abcF12.6318.44218.50911.41315.287P0.0000.0000.0000.0000.000

NAC：N-乙酰半胱氨酸；t-BHP:叔丁基氫過氧化物；ROS：活性氧類；SMA：平滑肌α-肌動蛋白；SMemb:平滑肌胚胎型肌球蛋白重鏈；a與對照組比較，P<0.05;b與35 μmol/L t-BHP組比較，P<0.05;c與35 μmol/L t-BHP+1mmol/L NAC組比較，P<0.05

3討論

As的發生與氧化應激有密切的關系。氧化應激可以損傷VSMC，介導As從脂紋、脂斑形成到斑塊破裂的整個病程[5-6]。但是氧化應激損傷VSMC的機制較為復雜，大部分研究認為氧化應激主要引起VSMC的凋亡，造成血管結構破壞[7]。但是氧化應激對VSMC的表型影響還尚未有研究證實。As發生的不同時期，VSMC增殖/凋亡失衡的表現不同，除VSMC增殖與As有關外，VSMC的表型變化也是As發生的重要環節，VSMC表型向合成型轉換后，其收縮功能消失，而分泌功能增強,遷移至內膜下間隙大量增殖也是As發生的重要因素[6]。本研究結果顯示，使用t-BHP誘發氧化應激后，MOVA細胞的收縮型標志物SMA表達降低，而合成型標志物SMemb表達增高，提示氧化應激確實可以造成VSMC的表型轉換。從這個角度考慮，逆轉VSMC的表型轉變也許可以作為預防氧化應激引起As的思路。本研究使用NAC處理t-BHP 暴露后的MOVA細胞后，細胞增殖抑制程度緩解，凋亡率下降，同時NAC處理后，相比單純t-BHP暴露的MOVA細胞，收縮型標志物SMA表達增多，合成型標志物SMemb降低，提示NAC可以緩解t-BHP引起的氧化損傷，同時還能防止MOVA細胞的表型轉化。NAC是一種抗氧化劑，可以通過維持谷胱甘肽的濃度來對抗H2O2、自由基、脂質過氧化物等物質引起的氧化應激[8]。但是NAC通過何種機制發揮保護作用，還有待解釋，因此本研究進一步考察了miR-145在NAC處理過程中的表達變化。miR-145是miRNA的一種，后者是真核生物中廣泛存在的一種長為21～23個核苷酸的RNA分子，可調節多種基因的表達，進而影響細胞的分化、凋亡等活動[9]。miR-145是血管平滑肌表型調節過程中的關鍵因子,而表型調節過程是多種血管性疾病的共同病理過程[10]。本研究結果顯示，t-BHP處理可以降低miR-145的表達，NAC處理可以提高miR-145的表達，因此可以假設NAC的保護作用還與miR-145的表達有關。

但目前還少有研究闡明miR-145的調控機制，有待于進一步研究。未來可借助慢病毒載體轉染miR-145來進一步解釋NAC保護VSMC的機制。

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N-acetyl Cysteine′s Role in Attenuating Injury and Phenotype Change of Vascular Smooth Muscle Cells Induced by Oxidative StressFANMing-qiang,ZHANGYan-lin,DINGTao,WANGYing.(DepartmentofCardiology，PingliangCityPeople′sHospital，Pingliang744000,China)

Abstract：ObjectiveTo explore the role of N-acetyl cysteine(NAC) in attenuating injury and phenotype shift of vascular smooth muscle cells(VSMC) induced by oxidative stress.MethodsMouse VSMCs(MOVAS cells) were divided into four groups after routine culture,including 35 μmol/L t-BHP treated group,35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC treated groups and 1 mmol/L NAC treated group,and control group.Intracellular ROS level in each group was detected by DCFH-DA probe.CCK-8 assay was used to detect the inhibition rate of each group.mRNA expression level of SMemb and SMA in MOVAS cells were analyzed by real-time quantitative PCR,protein expression level of SMemb and SMA were measured by Western blot.The effects of NAC and t-BHP on the expression of miR-145 was analyzed as well.ResultsAfter treatment with 35 μmol/L t-BHP,the intracellular level of ROS increased significantly,compared with the control group,the difference was significant(P<0.05).Compared with 35 μmol/L t-BH group,in 35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC group,the intracellular ROS level was lower (P<0.05).After the treatment of 35 μmol/L t-BHP,cell inhibition rate,apoptosis rate were increased,compared with the control group,the difference was significant(P<0.05).Compared with 35 μmol/L group t-BHP,in 35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC group,the cell inhibition rate and apoptosis were lower(P<0.05).Compared with control,the expression of SMA was decreased and the expression of Smemb was increased after 35 μmol/L t-BHP treatment,the difference was significant(P<0.05).Compared with 35 μmol/L t-BHP group,in 35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC group,the SMA expression was higher and the SMemb was lower(P<0.05).35 μmol/L t-BHP treatment can decrease the expression of miR-145,compared with the control group,the difference was significant (P<0.05).Compared with 35 μmol/L t-BHP group,in 35 μmol/L t-BHP+1 mmol/L NAC group,the miR-145 expression was higher(P<0.05).ConclusionOxidative stress induced VSMC damage and phenotype change can be attenuated by NAC,which involves the miR-145 expression increase.

Key words：N-acetyl cysteine; Vascular smooth muscle cell; Oxidative stress; MicroRNA

收稿日期：2014-10-20修回日期：2015-03-13編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.19.048

中圖分類號：R365

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)19-3589-03