阿爾茨海默病患者外周血單核細胞中CD33的表達情況

朱　黎，成旭東，安燕芳

(徐州市第一人民醫院老年科，江蘇 徐州 221000)

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阿爾茨海默病患者外周血單核細胞中CD33的表達情況

朱黎※，成旭東，安燕芳

(徐州市第一人民醫院老年科，江蘇 徐州 221000)

摘要：目的研究阿爾茨海默病(AD)患者外周血單核細胞CD33的表達情況，探討其作為血液生物標志物的可行性。方法收集2011年1月至2013年3月徐州市第一人民醫院收治的100例AD患者(AD組)和100例認知正常老年人(對照組)的臨床資料和外周靜脈血標本,分離外周血單核細胞，采用實時熒光定量多聚酶鏈反應測定CD33mRNA表達水平，流式細胞儀分析CD33陽性細胞率。采用Pearson相關分析CD33表達與簡易精神狀態檢查(MMSE)評分的關系。結果AD患者CD33mRNA表達水平和CD33陽性細胞率均顯著低于對照組[0.89±0.28 比1.06±0.33；(40±15)%比(55±21)%]，差異有統計學意義(P<0.01)。CD33mRNA表達水平、CD33陽性細胞率與MMSE評分呈正相關(r=0.78，0.22，P<0.05)。結論CD33可能參與AD的發病過程，CD33作為AD臨床診斷生物標志物具有一定的可行性。

關鍵詞：阿爾茨海默病；CD33；外周血單核細胞；生物標志物

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種最常見的年齡相關性癡呆,60歲以上人群患病率高達1.6%，目前AD患者約530萬人，2050年預計將達到1350萬人，AD已成為一種嚴重影響老年人身心健康的公共衛生問題[1]。由于AD發病機制復雜，疾病產生的原因和機制尚不明切，目前仍無有效治療方法，且發病隱匿，只有當個體表現出認知、行為障礙時才能進行診治，因此，對AD早期診斷并干預治療具有重要價值[2]。但批準的、公認的用于AD檢測的生物標志物尚不存在，疾病的發生、進展無法得以確定。CD33分子主要存在于血液、骨髓和淋巴細胞中，相對分子質量為67 000，屬于唾液酸結合免疫球蛋白的凝集素家族成員，大范圍全基因組相關研究表明，CD33與AD密切相關[3-4]。本研究主要探討CD33的表達與AD患者認知功能的關系，為AD診斷和治療提供思路和依據。

1資料與方法

1.1一般資料收集2011年1月至2013年3月徐州市第一人民醫院收治的符合精神疾病診斷和統計手冊[5]及美國國立神經病、語言交流障礙和卒中研究所-老年性癡呆及相關疾病學會診斷標準[6]的AD患者100例(AD組)，記憶障礙和遺忘為主訴，病程6個月至4年。采用簡易精神狀態量表(mini-mental state examination，MMSE)和蒙特利爾認知評估量表(montreal cognitive assessment，MoCA)對患者進行認知功能評定。排除標準：①其他癡呆相關的神經系統疾病，如癲癇、帕金森病、亨廷頓病、抑郁癥、精祌分裂癥、精神發育遲滯者；②藥物濫用，有既往腦血管病、腦積水、腦炎或腦膜炎病史者；③頭部外傷或各類中毒導致認知功能障礙者；④嚴重的肝、腎功能損害及惡性腫瘤患者；⑥嚴重視覺或聽覺障礙，不能配合檢查者。另擇上述AD組患者配偶或同期收治的認知正常的老年人為對照組,共100例，對照組排除標準同AD組。

1.2外周血單核細胞分離清晨空腹采集外周靜脈血約2 mL，乙二胺四乙酸抗凝血，加入2 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)稀釋后，緩慢加入5 mL Ficoll淋巴細胞分離液(BD，美國)，以離心半徑13 cm，2000 r/min離心20 min，分離中間的血漿單核細胞層，PBS沖洗2次，以離心半徑13 cm，1500 r/min，離心10 min，棄上清液，收集下層液以PBS稀釋調整濃度，配制成1×106/mL的細胞懸液備用。

1.3CD33mRNA定量檢測分離出外周血單核細胞后，采用Trizol試劑盒(天澤恩，中國)提取總RNA，逆轉錄試劑盒(Takara，中國)將RNA逆轉錄成cDNA。熒光定量檢測試劑盒(Takara，中國)，CD33引物為F端序列:5′-GAAAGCAGCCAGGACAGCA-3′，R端序列： 5′-CTGAACAGCTTGAGGGTT-TCAGTG-3′；甘油三磷酸脫氫酶引物為F端序列:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′、R端序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。采用實時熒光定量多聚酶鏈反應擴增儀(BIORAD，美國)進行實時熒光定量多聚酶鏈反應，20 μL反應體系：包括2×SYBR Green實時熒光定量多聚酶鏈反應緩沖液10 μL,4種引物各0.4 μL(10 μmol/L)，cDNA模板2 μL，雙蒸水6.4 μL。反應參數:95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環。每個樣本2個復孔，2-ΔΔCT法計算CD33mRNA的相對表達量。

2結果

2.1兩組受試者一般特征的比較兩組性別、年齡、受教育年限比較差異無統計學意義(P>0.05)，AD組MMSE和MoCA 評分均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1　兩組受試者一般特征的比較

AD：阿爾茨海默病；MMSE：簡易精神狀態量表；MoCA：蒙特利爾認知評估量表；a為χ2值，余為t值

圖1　CD33陽性流式細胞儀計數　1A：對照組； 1B：阿爾茨海默病組

圖2　對照和阿爾茨海默病(AD)組外周血單核細胞CD33表達　2A： CD33 mRNA相對表達量； 2B： CD33陽性率2.3　AD患者CD33表達與MMSE的相關性分析　CD33 mRNA表達與MMSE評分呈正相關(r=0.78，P<0.05)；CD33陽性單核細胞比率與MMSE評分呈正相關(r=0.22，P<0.05)。

3討論

CD33屬于免疫球蛋白超家族的成員,與蛋白酪氨酸磷酸酶結合向細胞內傳遞抑制性信號，參與細胞增殖調節、細胞因子分泌等過程[7]。但目前CD33的信號傳遞通路仍沒有很好地描述,實驗模型顯示[8-9]，其下游信號分子包括泛素連接酶、脾酪氨酸激酶等。在髓系細胞中脾酪氨酸激酶信號通路與細胞黏附、增殖、分化、凋亡有關。CD33屬于髓系分化抗原,主要分布于髓系細胞,其研究主要是急性髓系白血病治療,已有一些以CD33為靶點的藥物處于臨床研究階段，用于白血病的治療[10]。病理組織學顯示，AD患者大腦皮質CD33異常表達[11]。一項關于中國北方漢族人群遲發型AD的全基因組關聯分析表明，CD33基因與AD發病密切相關[12]。

由于AD主要表現為認知功能障礙，MMSE是最常用的癡呆及認知功能評價表，量表包含記憶力、視空間功能、執行功能、注意力、計算力、語言功能、定向力等方面的內容，具有操作簡便、耗時短等優點，以MMSE得分反映認知功能受損程度具有一定的特異性[16]。本研究探討了CD33表達水平和認知功能的相關性，Pearson相關分析表明，AD患者外周血單核細胞的CD33mRNA表達水平和CD33陽性單核細胞率與MMSE得分呈正相關，提示檢測外周血單核細胞CD33表達水平作為AD預測的標志物具有一定的應用潛力。CD33在急性髓系白血病相關的鑒別診斷中已顯示了較好的敏感性[17]。有研究小組正致力于將一個治療急性髓性白血病失敗的藥物林妥珠單抗用于AD的治療，林妥珠單抗已通過人體安全測試，有望成為AD的克星，也為AD的診斷、治療研究提供了新策略[18]。

綜上所述,AD患者外周血細胞中CD33的表達明顯高于認知正常老年人，具有一定的臨床意義，該方法特異性高，且外周血檢查對人體傷害性低，CD33有望成為用于AD診斷的一種新的特異性明顯的生物學標志物。但是，通過外周血檢測CD33是否能區分不同疾病程度的AD患者，特別是對于輕度認知障礙的AD患者，是否還具有特異性仍值得探討；對于AD患者外周血中CD33表達下調的相關機制，有待進一步研究。

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Application of CD33 as Blood Biomarker in Alzheimer DiseaseZHULi,CHENGXu-dong,ANYan-fang.(DepartmentofGeriatrics,FirstPeople′sHospitalofXuzhou,Xuzhou221000,China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the feasibility of CD33 expression in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) as a biomarker in Alzheimer disease(AD).MethodsA total of 200 cases in Xuzhou First People′s Hospital were selected from Jan.2011 to Mar.2013,including 100 AD patients and 100 controls.CD33mRNA level was determined by real-time quantitative polymerase chain reaction and the CD33positive monocytes was analyzed by flow cytometry.Pearson correlation was performed to analyze the correlation between CD33expression and Mini Mental State Examination(MMSE) score.ResultsThe expression of CD33mRNA and proportion of CD33positive monocytes were significantly decreased in AD patients compared with the controls[0.89±0.28 vs 1.06±0.33，(40±15)% vs (55±21)%，P<0.01].Regression analysis showed the expression of CD33mRNA,CD33positive monocytes had positive relationship with the MMSE score(r=0.78，0.22，P<0.05).ConclusionCD33may play an important role in the pathogenesis of AD and is feasible to serve as a blood biomarker in AD diagnosis.

Key words：Alzheimer disease; CD33; Peripheral blood mononuclear cells; Biomarker

收稿日期：2015-05-21修回日期：2015-08-04編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.19.069

中圖分類號：R392

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)19-3642-03