新型mTORC1/mTORC2雙重抑制劑OSI-027對人結腸癌細胞株HT-29的體外抑制作用

陳國平　曹大春　劉海林

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院消化科，上海　200011)

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·論著·

新型mTORC1/mTORC2雙重抑制劑OSI-027對人結腸癌細胞株HT-29的體外抑制作用

陳國平曹大春劉海林

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院消化科，上海200011)

摘要目的：探討新型mTORC1/mTORC2雙重抑制劑OSI-027對人結腸癌細胞株HT-29的體外抑制作用。方法：體外培養的人結腸癌HT-29細胞株，給予不同濃度(0.1、1、10、25、50 nmol/L)的OSI-027處理，或以25 nmol/L OSI-027 處理0、24、48、72、96 h后，采用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法、細胞集落形成實驗觀察HT-29細胞的生長增殖情況；應用流式細胞儀(FACS)及臺盼藍染色法檢測OSI-027處理后HT-29細胞的凋亡和死亡情況；采用蛋白質印跡(Western blotting)法檢測HT-29細胞凋亡相關蛋白cleaved-caspase-3和細胞色素C(cytochrome C)的表達。結果：OSI-027可抑制HT-29細胞的存活，且呈濃度和時間依賴性；還可抑制HT-29細胞的增殖，呈濃度依賴性；此外，OSI-027還能誘導HT-29細胞的凋亡和死亡，并呈濃度依賴性。OSI-027處理后，HT-29細胞中凋亡相關蛋白cleaved-caspase-3和cytochrome C的表達水平上調。結論：新型mTORC1/mTORC2雙重抑制劑OSI-027可抑制人結腸癌細胞HT-29的增殖并誘導細胞凋亡。

關鍵詞結腸癌；OSI-027；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白；凋亡；信號轉導

結腸癌的發病率在我國惡性腫瘤中居第3位，且呈逐年上升趨勢[1]。以往常用于結腸癌治療的奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶等藥物的不良反應較嚴重，且易產生耐藥性[2]。

研究[3-5]證實，PI3K-Akt-mTOR信號通路在結腸癌等多種實體惡性腫瘤中過度表達及活化。PI3K-Akt-mTOR信號通路可以通過多種機制誘導結腸癌的發生與發展，促進腫瘤細胞的存活、增殖、轉移，并抑制細胞凋亡等[3]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol-3-kinase，PI3K)信號通路中位于蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)下游的重要分子，有2種復合物mTORC1和mTORC2，參與調節蛋白質合成、細胞周期和細胞增殖。

近年來篩選出的新型mTOR特異性激酶抑制劑OSI-027能阻斷mTORC1和mTORC2的活性[6]。本研究旨在觀察OSI-027對人結腸癌細胞株HT-29的體外抑制作用。

1資料與方法

1.1材料人結腸癌細胞株HT-29及OSI-027均購自德國Calbiochem公司；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)檢測試劑盒、DMEM、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、碘化丙啶(propidium iodine，PI)凋亡試劑盒均購自美國Sigma公司。實驗所需的抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養人結腸癌細胞株HT-29用含10% FBS的DMEM培養液于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養，48 h更換一次培養液，3～4 d傳代1次。取對數生長期細胞進行細胞實驗。OSI-027以DMSO溶解，后續實驗中以等體積的0.1%DMSO作為對照。

1.2.3細胞集落形成實驗檢測細胞增殖將HT-29細胞接種于6孔板，每組設5個復孔，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中孵育過夜。給予不同濃度的OSI-027(0.1、1、10、25 nmol/L)或等體積DMSO處理8 d后，觀察直徑>50 μm集落的數目，并與對照組進行比較，實驗至少重復3次。細胞增殖率=實驗組直徑>50 μm集落的數目/對照組直徑>50 μm集落的數目×100%。

1.2.4流式細胞儀(FACS)檢測細胞凋亡將HT-29細胞接種于6孔板，每組3～4個復孔，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中培養。給予不同濃度的OSI-027(1、10、25和50 nmol/L)或等體積DMSO處理72 h后，采用Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒鑒別細胞凋亡類型，其中，Annexin-V-FITC陽性/PI陰性的細胞為早期凋亡細胞，Annexin-V-FITC陽性/PI陽性的細胞為晚期凋亡細胞，而Annexin-V-FITC陰性/PI陽性的細胞為非凋亡細胞。每個樣本至少檢測20 000個細胞，實驗至少重復3次。計算Annexin-V-FITC陽性細胞的比率，即為凋亡率。

1.2.5臺盼藍染色檢測細胞死亡將HT-29細胞接種于6孔板，每組3個復孔，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱培養。給予不同濃度的OSI-027(1、10、25和50 nmol/L)或等體積DMSO處理，72 h后對細胞進行臺盼藍染色，死亡細胞為臺盼藍染色陽性。實驗至少重復3次。細胞死亡率=實驗組臺盼藍陽性細胞數/對照組總細胞數×100%。

1.2.6蛋白質印跡(Western blotting)法檢測HT-29細胞凋亡相關蛋白的表達取培養的HT-29細胞，給予OSI-027(25 nmol/L)或等體積DMSO處理，24、48 h后，用RIPA裂解液提取HT-29細胞總蛋白并用考馬斯亮藍法(Bradford法)測定蛋白濃度。每孔上樣30 μg蛋白，用6%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離，電轉移至硝酸纖維素膜。加入1∶300的cleaved-caspase-3一抗和細胞色素C(cytochrome C)一抗后4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1000)后室溫孵育2 h。顯色拍照。

1.3統計學處理采用SPSS 18.0軟件進行統計學處理，計量資料采用單因素方差分析進行比較。P<0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1MTT法檢測結果OSI-027可抑制HT-29細胞的存活，且呈濃度和時間依賴性，見圖1~2。

與對照組比較，*P<0.05

圖1不同濃度OSI-027(處理72 h)對HT-29細胞

存活率的影響

與對照組比較，*P<0.05

圖2OSI-027處理不同時間對HT-29細胞存活率的影響

2.2細胞集落形成實驗結果OSI-027可抑制HT-29細胞的增殖，且呈濃度依賴性，見圖3。

2.3臺盼藍染色檢測結果OSI-027可誘導HT-29細胞的死亡，且呈濃度依賴性，見圖4。

2.4流式細胞儀檢測結果OSI-027可誘導HT-29細胞的凋亡，且呈濃度依賴性，見圖5。

2.5Western blotting法檢測結果OSI-027可誘導HT-29細胞凋亡相關蛋白的表達，且呈時間依賴性，見圖6。

與對照組比較，*P<0.05

圖3不同濃度OSI-027對HT-29細胞增殖率的影響

與對照組比較，*P<0.05

圖4不同濃度OSI-027對HT-29細胞死亡率的影響

A：對照組與OSI-027組(藥物組)記錄細胞凋亡；B：藥物組早期凋亡細胞；C：藥物組晚期凋亡細胞；與對照組比較，*P<0.05

圖5不同濃度OSI-027對HT-29細胞凋亡率的影響

與對照組比較，*P<0.05

圖6OSI-027對HT-29細胞凋亡相關蛋白cleaved-caspase-3和cytochrome C表達的影響

3討論

PI3K-Akt-mTOR信號通路中的mTOR信號分子參與調控能量代謝和細胞增殖；mTOR的2個直接底物，即p70S6K和4E-BP-1是蛋白質生物合成的關鍵因子[7]。mTOR的異常活化在腫瘤的發生、發展中有重要作用[7]。Ai等[8]研究發現，抑制mTOR能限制腫瘤細胞利用葡萄糖產生能量，阻止腫瘤細胞利用氨基酸合成新的蛋白質，從而抑制腫瘤的生長。最近有研究[9]發現，mTOR抑制劑(rapamycin)可明顯減少淋巴瘤和白血病細胞的ATP生成，但Efeyan等[10]發現，通過活化胰島素受體底物1(IRS-1)可負反饋活化存活通路Akt，抑制rapamycin及其類似物的療效；而且，rapamycin及其類似物還可負反饋活化的Erk/MAPK通路，進一步限制其療效[11]。而OSI-027是一種新近研發的mTOR抑制劑，能阻斷2種mTOR復合物的活性，常被稱為mTORC1/mTORC2雙重抑制劑，具有阻滯腫瘤細胞的細胞周期以及誘導其分化和凋亡的能力[12]，從而達到抗腫瘤的效果。

本研究結果顯示，外源性添加的mTORC1/mTORC2雙重抑制劑OSI-027可誘導結腸癌細胞HT-29的死亡，抑制HT-29細胞的存活和增殖，且其作用與藥物濃度及作用時間相關。隨著OSI-027濃度的增加及作用時間的增加，對HT-29的細胞毒作用也逐漸增加。OSI-027還同時誘導HT-29細胞凋亡，表現為Annexin V陽性細胞數目顯著增加，細胞內cleaved-caspase-3和cytochrome C蛋白的表達水平增加。

OSI-027阻斷HT-29細胞mTORC1和mTORC2的組裝和活化的機制尚有待于進一步明確。

參考文獻

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Inhibitory Effect of Novel mTORC1/mTORC2 Dual Inhibitor OSI-027 on Human Colon Cancer Cell Line HT-29 in Vitro

CHENGuopingCAODachunLIUHailin

DepartmentofGastroenterology,TheNinthPeople’sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200011,China

AbstractObjective： To investigate the inhibitory effect of novel mTORC1/mTORC2 dual inhibitor OSI-027 on human colon cancer cell line HT-29 in vitro.Methods： HT-29 cells, cultured in vitro，were either treated with different concentrations of OSI-027(0.1,1,10,25 and 50 nmol/L),or treated with 25 nmol/L OSI-027 for 0,24,48,72,96 h,respectively. Methyl thiazolyl tetrazolium assay(MTT) and cell colony forming assay were used to detect the growth and proliferation of HT-29 cells after treatment with OSI-027. Flow cytometry(FACS) and trypan blue staining were used to detect the influence of OSI-027 on apoptosis and death of HT-29 cells. Western blotting was used to detect the expression of apoptosis-related proteins cleaved-caspase-3 and cytochrome C.Results： OSI-027 inhibited the survival of HT-29 cells, and the inhibition was concentration and time dependent. It also inhibited the proliferation of HT-29 cells, and the inhibition was concentration dependent. It also induced apoptosis and death, and the inducement was concentration dependent.Expression levels of apoptosis-related proteins cleaved-caspase-3 and cytochrome C increased after OSI-027 treatment. Conclusions： The novel mTORC1/mTORC2 dual inhibitor OSI-027 can inhibit the proliferation of human colon cancer cell HT-29 and induce cell apoptosis.

Key WordsColon cancer；OSI-027；Mammalian target of rapamycin；Apoptosis；Signal transduction

中圖分類號R735.3

文獻標識碼A

通訊作者劉海林，E-mail：liuhailin@medmail.com.cn