葡萄糖調節蛋白-78和磷酸化真核翻譯啟動因子2α在膀胱尿路上皮癌中的表達及臨床意義

賈躍軍, 葛廣成, 李中興, 馮　瑞, 沈　斌, 吳　丹, 王　星

(江蘇省鎮江市第二人民醫院 泌尿外科, 江蘇鎮江, 212000)

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葡萄糖調節蛋白-78和磷酸化真核翻譯啟動因子2α在膀胱尿路上皮癌中的表達及臨床意義

賈躍軍, 葛廣成, 李中興, 馮瑞, 沈斌, 吳丹, 王星

(江蘇省鎮江市第二人民醫院 泌尿外科, 江蘇鎮江, 212000)

摘要:目的分析葡萄糖調節蛋白-78(GRP78)及磷酸化真核翻譯啟動因子2α( P-eIF2α)在正常膀胱黏膜組織和膀胱泌尿上皮癌組織中的表達。方法采用Western blot法檢測16對膀胱癌和正常膀胱活檢新鮮組織的GRP78和P-eIF2α蛋白的表達水平。采用免疫組織化學方法檢測67例膀胱泌尿上皮癌組織中GRP78蛋白的表達，并分析其蛋白表達水平與臨床病理特征之間的相關性。結果GRP78蛋白在膀胱泌尿上皮癌中表達較正常膀胱黏膜組織中上升。免疫組織化學染色結果顯示膀胱泌尿上皮癌組織中的GRP78的表達水平與臨床分期、浸潤深度及淋巴結轉移呈正相關(P<0.05)。結論在膀胱泌尿上皮癌中，GRP78較正常組織中表達上調，并且與膀胱泌尿上皮癌的浸潤深度及淋巴結轉移相關, P-eIF2α在癌組織與正常組織中表達無顯著差異。

關鍵詞:葡萄糖調節蛋白-78; 磷酸化真核翻譯啟動因子2α; 膀胱尿路上皮癌

膀胱腫瘤是泌尿系統常見腫瘤之一，在中國人群中，是排名第10位的常見惡性腫瘤[1]，其中膀胱尿路上皮癌是最常見的病理類型。2005年，中國死于膀胱癌的患者達17 365人，隨著環境因素的惡化，自1995—2005年，膀胱癌的發病率逐年上升[2]。由于膀胱癌易于復發，并且針對T2和T3期膀胱癌的大型隨機實驗及薈萃分析結果顯示，輔助化療僅可使產生輕度生存獲益[3-4]。因此，尋找膀胱尿路上皮癌新的腫瘤標記物和靶向治療靶點對于膀胱癌的診斷、治療及預后尤為重要。

葡萄糖調節蛋白-78(GRP78)是熱休克蛋白70家族中的一員，定位于內質網，一方面它協助蛋白質正確折疊，阻止錯義蛋白質聚集，另一方面它是未折疊蛋白反應(UPR)通路的核心成員，一旦錯義蛋白聚集，GRP78表達增加，并與PEPK、AFT6以及IRE1α分離，從而啟動UPR通路[5]。在正常組織如腦、肺、心臟等中，GRP78低水平表達，但在多種腫瘤組織中，它的表達水平明顯增加，使腫瘤細胞適應缺氧、葡萄糖缺乏環境，避免凋亡的歸宿，并且與預后相關[6-9]。

在真核細胞中，磷酸化真核翻譯啟動因子2α(P-eIF2α)既可以通過抑制 PI3K-Akt信號通路發揮抗細胞凋亡的作用，又可以通過影響抑癌基因PTEN的功能促進細胞凋亡[10]。 PEPK/eIF2α/CHOP作為內質網應激信號通路之一，eIF2α的磷酸化激活在其中起到了重要的作用。本研究采用Western blot方法檢測GRP78和P-eIF2α蛋白在正常膀胱黏膜及膀胱尿路上皮癌中的表達，以及采用免疫組織化學的方法檢測GRP78蛋白在膀胱癌組織中的表達，并探討其表達與膀胱尿路上皮癌各臨床病理參數之間的關系。

1材料與方法

1.1　臨床樣本與試劑

收集2012—2013年于鎮江市第二人民醫院及鎮江市第一醫院泌尿外科就診膀胱尿路上皮癌患者的新鮮癌組織及正常膀胱黏膜活檢組織各16例，收集后立即處理，RIPA裂解提取總蛋白，保存于-80℃冰箱。收集2010—2013年膀胱泌尿上皮癌石蠟樣本共67例，全部病理切片經2位資深病理科診斷醫師確診。所有病人術前均未接受放化療。

1.2　試劑

兔抗人GRP78多克隆抗體和兔抗人P-eIF2α多克隆抗體(Santa Cruz)，辣根過氧化物酶-羊抗兔酶標二抗(Santa Cruz)，其他試劑購自Sigma公司。

1.3　實驗方法

1.3.1Western blot法檢測GRP78及P-eIF2α蛋白在膀胱尿路上皮癌及癌旁組織中表達:取癌組織及正常膀胱黏膜活檢組織(約0.2 g)，加入RIPA裂解液(1 mL/0.1 g組織裂解液內含蛋白酶抑制劑及磷酸化酶抑制劑)，機械低溫勻漿，后4 ℃, 12 000 r/min離心15 min, 上清即為總蛋白樣品。經Bradford法蛋白定量后，取等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳。半干式轉膜后，經5%脫脂牛奶室溫封閉2 h后GRP78(1∶2 000稀釋)、P-eIF2α(1∶1 000稀釋)4 ℃過夜，TBST液洗膜10 min×3次后，HRP-羊抗兔酶標二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1.5 h, TBST液洗膜5 min×6次，1 mL顯影液顯影后曝光。

1.3.2免疫組織化學染色:SP法免疫組織化學染色。將石蠟包埋的膀胱泌尿上皮癌組織連續切片為3 μm厚薄片，經二甲苯、梯度濃度乙醇脫蠟水化、經枸櫞酸抗原修復液高溫高壓抗原修復，并使用3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，即用型山羊血清封閉非特異性結合位點，滴加適量PBS稀釋兔源GRP78一抗(1∶400稀釋)止于4 ℃過夜，經PBS充分洗脫后，滴加適量抗兔HRP偶聯二抗，室溫孵育30 min, 經PBS充分洗滌后，DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色程度，自來水終止顯色。蘇木素復染，中性樹膠封片后，由2位有經驗的病理醫師各自獨立讀片。

1.3.3免疫組化判讀標準:GRP78陽性部位見于胞漿，偶也可見于胞膜，呈棕黃色。PBS代替抗體作為陰性對照。根據GRP78著色范圍及強度評分，著色范圍評分標準為：陰性為0，1%～10%為1，11%～50%為2，51%～80%為3，81%～100%為4；染色強度評分標準為：陰性為0，弱為1，中為2，強為3。上兩者的乘積為最后得分: 0為(-)，1～4為(+)，5～8為(2+)，9～12為(3+); <5分為低表達組，即陰性組，≥5分為高表達組，即陽性組。膀胱泌尿上皮癌GRP78蛋白表達情況見表1。

2結果

2.1　GRP78及P-eIF2α蛋白在膀胱泌尿上皮癌及癌旁組織中的表達。

Western blot結果顯示，GRP78蛋白在膀胱泌尿上皮癌中的表達量較正常組織中升高，16對癌與癌旁組織中結果一致，且差異具有統計學意義(P<0.05)。P-eIF2α蛋白在膀胱泌尿上皮癌中的表達較正常組織中無明顯差異。見圖1。

圖1 GRP78及P-eIF2α蛋白在膀胱泌尿上皮癌 及癌旁組織中的表達

2.2　GRP78蛋白在膀胱泌尿上皮癌中的表達與臨床病理參數之間的聯系

膀胱泌尿上皮癌中GRP78的表達與年齡、性別、分化程度無關，與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移呈正相關。見表1。

表1　石蠟樣本的臨床病理信息

3討論

膀胱泌尿上皮癌作為泌尿系統常見腫瘤之一，具有易復發、生物學行為多樣復雜的特點，并且缺乏特異敏感的藥物。因此，探索其發病機制，尋找可以預測其預后的腫瘤標記物，以及特異性治療靶點具有深刻的意義。

GRP-78屬于熱休克蛋白70家族一員，在正常細胞中主要參與未折疊蛋白反應，降解錯義蛋白，維持細胞的正常功能。已有的研究顯示，GRP78在腫瘤細胞的增殖方面主要起到以下幾方面的作用: ① 腫瘤細胞長期生存于缺氧、葡萄糖匱乏的環境中，往往產生過量的變異新蛋白[11]，引起內質網應激。因此，GRP78在多種腫瘤細胞中過表達以減輕應激，維持細胞的生存和增殖[6-9,12-13]; ② GRP78在維持細胞內Ca2+穩定，維持細胞內環境穩定中起到重要作用。另外，多個研究[14-16]表明, GRP78的過度表達與腫瘤細胞耐藥性、腫瘤血管形成相關，對腫瘤細胞使用針對GRP78的藥物或者多肽，可誘導細胞凋亡，減少腫瘤血管形成，減輕腫瘤細胞的耐藥。

本研究發現，GRP78在膀胱泌尿上皮癌中表達較正常組織中增加，并且在膀胱泌尿上皮癌中GRP78的表達與腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移呈正相關，但是與癌組織的分化程度不具有統計學相關性。此研究結果顯示，GRP78的表達增加在膀胱泌尿上皮癌的侵襲和轉移過程中可能發揮一定的作用。并且，GRP78在膀胱泌尿上皮癌中的表達上調，有可能成為治療膀胱泌尿上皮癌的潛在靶點。

本研究中，正常膀胱組織中和膀胱泌尿上皮癌中的P-eIF2α表達水平無明顯差異，說明在膀胱癌中，eIF2α的磷酸化水平較正常組織中無明顯差異，GRP78的上調表達可能并不是通過激活PEPK/eIF2α/CHOP應激信號通路實現的，還需要進一步的研究來探討GRP78上調與ATF6 和 IRE1/XBP1內質網應激通路在膀胱泌尿上皮癌的發生、發展過程中的作用機制。

綜上所述，在膀胱泌尿上皮癌中，GRP78較正常組織中表達上調，并且與膀胱泌尿上皮癌的浸潤深度及淋巴結轉移相關，說明GRP78在膀胱癌的發生發展中起到重要作用，并可以提示預后。P-eIF2α在癌組織與正常組織中表達沒有差異性提示在膀胱癌中PEPK/eIF2α/CHOP內質網應激信號通路沒有激活。因此，需要進一步探討GRP78以及內質網應激通路在膀胱泌尿上皮癌中的作用機制，而且針對GRP78靶向藥物能否成為治療膀胱泌尿上皮癌的新熱點仍有待于進一步的探索。

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Clinical significance and expression of GRP78 and P-eIF2α in urothelial carcinoma of bladder

JIA Yuejun, GE Guangcheng, LI Zhongxing, FENG Rui,

SHEN Bin, WU Dan, WANG Xing

(DepartmentofUrology,ZhenjiangSecondPeople′sHospital,Zhenjiang,Jiangsu, 212000)

ABSTRACT:ObjectiveTo analyze the expression and significance of GRP78 and P-eIF2α in bladder urothelial carcinoma and normal mucosa. MethodsWestern blot was used to detect expression of GRP78 and P-eIF2α levels in 16 couples of cancer tissue and normal mucosa. Immunohistochemistry was used to detect expression of GRP78 level in 67 formalin-fixed paraffin-embedded bladder urothelial carcinoma, and correlation between GRO78 level and clinical pathological features was analyzed. ResultsThe results showed that the expression of GRP78 was up-regulated in cancer tissue, and the level of GRP78 expression was correlated with the depth of invasion, positive lymph node metastasis and TNM stage. ConclusionIn bladder urothelial carcinoma, level of GRP78 is up-regulated when compared with normal tissue, and is correlated with the depth of invasion and lymphatic metastasis of bladder urothelial carcinoma, but the expression of P-eIF2α shows no significant difference in carcinoma tissue and normal tissue.

KEYWORDS:GRP78; P-eIF2α; bladder urothelial carcinoma

收稿日期:2015-03-19

中圖分類號:R 737.14

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)17-035-03

DOI:10.7619/jcmp.201517011