二噁英類化合物的毒性作用機制及其生物檢測方法

黃超，陳凝,2，楊明嘉,*，馮忠孚，馬梅，王子健

1. 中國科學院生態環境研究中心 環境水質學國家重點實驗室，北京 100085 2. 安徽省環境科學研究院，安徽 230071 3. 天津博納艾杰爾科技有限公司，天津 300462

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二噁英類化合物的毒性作用機制及其生物檢測方法

黃超1，陳凝1,2，楊明嘉1,*，馮忠孚3，馬梅1，王子健1

1. 中國科學院生態環境研究中心 環境水質學國家重點實驗室，北京 100085 2. 安徽省環境科學研究院，安徽 230071 3. 天津博納艾杰爾科技有限公司，天津 300462

二噁英類化合物具有高毒性，來源多樣且分布廣泛，是持久性有機物的典型代表，二噁英類污染物及其對健康的危害已引起了公眾的普遍關注。一些二噁英類同系物具有代謝穩定性，其毒性效應主要是通過芳香烴受體介導，而越來越多的研究表明二噁英類毒性作用機制的復雜性。在此背景下，綜述了近些年在二噁英類毒性作用機制及其代謝途徑的新認識，評價比較了主要二噁英類高通量生物檢測方法，以期為該類污染物的環境污染物篩查和風險評估提供參考。

二噁英類；芳香烴受體；毒性作用機制；代謝；生物檢測

二噁英類污染物主要包括多氯二苯并-P-二噁英(PCDDs)，多氯二苯并呋喃(PCDFs)和共平面多氯聯苯(PCBs)，除了具有性質穩定、長代謝半衰期和強親脂性的特點外，在生物體內均能夠作用于芳香烴受體(AhR)。二噁英類具有高毒性，來源多樣且分布廣泛，人類通過食物鏈攝取低劑量的二噁英類，并通過體內累積和富集作用，是產生健康危害的重要途徑[1]。二噁英類污染及其對健康的危害已經引起了公眾普遍的關注。

目前的研究指向二噁英類的毒性效應主要是通過AhR介導。然而，大量有關于AhR作用機理的研究則表明了AhR信號通路本身的復雜性[2]。 除了AhR經典信號通路，一些非經典的AhR作用模式也被不斷挖掘，但當前可以肯定的是二噁英類所產生的毒性效應主要是通過AhR經典信號通路，并在基因表達水平改變而造成的。由二噁英類應答產生的細胞色素P450單加氧化酶(cytochrome P450 monooxygenases, CYPs)是其主要的代謝酶[3]，二噁英類極難代謝，能夠持續的激活CYPs，直接影響細胞的代謝過程，二噁英類的代謝途徑決定著這些化合物的持久性和隨后的生物毒性作用[3-4]。因此基于對AhR信號通路的認識，現已開發出多種不同的二噁英類生物檢測方法。這些方法通常具有高靈敏度，低成本，高通量的特點，能夠快速篩查大量樣品的二噁英類含量水平；還能以AhR誘導效應為終點(endpoint)，評價實際樣品或未知化合物的毒性。本文就近些年有關于二噁英類的毒性作用機制和代謝過程的新進展進行綜述，試圖展現一個更為完整和復雜的二噁英類在體內的毒性作用模式；并綜述和評價了在毒理學作用機理基礎上發展的主要二噁英類高通量生物檢測方法,。

1 由AhR介導的二噁英類毒性效應

1.1 二噁英類的毒性效應

二噁英類暴露以及其在生物體內的富集和累積對不同物種和組織的毒性效應是多終點的，主要的毒性作用有急性毒性、致癌性和致畸性，主要的器官毒性包括了肝毒性、皮膚毒性、內分泌毒性、生殖毒性、神經系統毒性和呼吸毒性[5]。雖然這些毒性效應與二噁英類暴露具有直接的關聯，但是對其分子作用機制仍缺乏足夠了解。需要指出的是二噁英類的毒性效應具有物種特異性，例如TCDD對豚鼠的急性致死毒性比倉鼠大5 000倍[6]，而人類比絕大多數物種對二噁英具有更低的敏感度[7]，不同個體之間這種敏感性也具有顯著性差異[8]。但當前研究已揭示包括二噁英類在內的眾多AhR配體主要通過激活或抑制AhR，從而引起了最終的生物學和毒理學效應。

1.2 AhR受體及其配體

AhR是bHLH-PAS家族中一類配體依賴性的轉錄激活因子，能夠引起AhR應答的配體包括了內源和外源化合物，活化的AhR通過誘導和抑制生物體內一系列基因的表達而產生生物學和毒理學效應[9-10]。大量的研究已表明，在正常生理狀態下下，AhR廣泛參與了生物體內源性調控[11]，McMillan發現，被氧化的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)極有可能具有激活AhR的能力，這一結果暗示AhR可能參與了LDL的代謝途徑[12]。雖然AhR所參與的內源性調控是一個研究熱點，但目前并沒有發現強親和性的內源AhR配體，更為關注的是能夠引起AhR應答并造成毒理學效應的外源化合物。在環境中廣泛存在的二噁英類和芳香烴類環境污染物普遍對AhR具有強親和性,更新的研究揭示AhR能夠被其他一些不同結構的化合物所激活[11,13]。因此，不同類型的AhR配體可能對AhR的作用機制并不相同。在未來的工作中，AhR的配體結合域PAS B LBD的結構信息可能是了解這種作用機制的關鍵，已經解析出來的PAS家族的同源蛋白的結構信息使我們對AhR同配體的作用方式有了一定的認識[14-15]，但是目前仍然不清楚的是AhR的LBD是如何同數量龐大且結構各異的配體發生特異性結合，并且這種特異性結合是如何產生不同的生物學和毒理學效應。可以確定的是，二惡英類及其類似的外源化合物最終的毒性效應主要是通過AhR介導后，在生物體內基因表達水平的改變所引起的。

1.3 AhR分子作用機制

1.3.1 AhR的非經典信號通路

AhR經典信號通路認為AhR的激活是配體依賴的[15]，然而越來越多的研究表明了AhR介導的毒性作用機制的復雜性，其可能的作用方式包括：(1)AhR存在配體非依賴性激活途徑，如依賴AhR或依賴AhR-ARNT的復合體，也可作為獨立的共激活因子(coactivator)作用于其他轉錄激活因子(RelA)[16]，或者標記這些轉錄因子作為降解雌激素受體(ER)的信號[17]；(2)二噁英應答元件(DRE)并不是AhR受體唯一結合的上游應答元件。AhR通過ARNT或者其他轉錄激活因子二聚化后，結合在DRE替換位點上能夠引起其他基因的轉錄激活(RelB)[18]或抑制(ER)[19]；(3)AhR能與其他轉錄激活因子共競爭ARNT或共激活因子，引起包括阻斷ERβ轉錄[20]、激活其他細胞信號通路[21]等。這些非經典信號通路豐富了二噁英類等其他AhR配體所引起的毒性效應的形成途徑。但總體而言，二噁英類等通過AhR非經典信號通路所貢獻的毒性效應相對較小，一些針對AhR基因敲出小鼠的暴露實驗研究表明，AhR經典信號通路是二噁英類等其他AhR配體產生毒性效應的主要形成途徑[22]。

1.3.2 AhR的經典信號通路

二噁英類等的親脂性使得其容易通過血清中的低密度脂蛋白轉運進入細胞內與AhR相結合[22]，使得AhR體構型發生轉變，使其從先前的p23、XAP2和伴侶蛋白hsp90復合體解離并激活后進入核內。此時細胞核內的芳香烴受體核轉位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT)與AhR異源二聚化，形成的二噁英-AhR-ARNT的復合體。這個復合體對DRE具有高度親和性，可以作為轉錄激活因子在DRE處招募其他轉錄蛋白，引起下游序列的轉錄和翻譯[23]。二噁英能夠引起多種P450酶系中蛋白的表達，但主要是以CYP1A亞科中CYP1A1和CYP1A2協同誘導為主，普遍認為其中CYP1A1除非被誘導，否則不會在肝細胞中內源性的表達[24]。

AhR的調控存在多種途徑，包括對在核內或對轉運至細胞質中游離的AhR泛素化，從而引導AhR被核內或細胞質中的26S蛋白酶降解[25]。而在另一種AhR負反饋條件機制中，與AhR和ARNT同源的配體非依賴性蛋白-芳香烴抑制因子(aryl hydrocarbon receptor repressor, AhRR)，在AhR被激活后被同時表達，AhRR能夠同AhR競爭結合ARNT，而AhRR缺乏轉錄激活域，結合在DNA上的AhRR：ARNT復合體不能引起下游基因的表達[26]。然而這兩種調控途徑并不能完全阻斷由二噁英類等啟動的AhR的信號通路。二噁英類尤其是2,3,7,8-TCDD，具有相當長的代謝半衰期[27]，能夠長時間結合AhR使其活化并連續的激活下游信號通路。因此可以認為是代謝穩定AhR配體(例如二噁英類)而不是代謝不穩定的AhR配體(例如PAHs)產生了更為主要的毒性效應[2]。

2 AhR配體的代謝

外源化合物的代謝和消除決定了這些化合物在機體內的持久性和隨后的生物學毒性作用[24]。大部分外源性的和內源性的AhR配體經過AhR介導產生同樣經歷I或II相代謝反應，這些化合物首先經過I相(Phase I)反應引入極性基團，然后I相反應產物作為II相反應的底物，被II相(Phase II)反應中的各類綴合酶等引入谷胱甘肽、硫酸酯或糖類等大分子取代基，顯著的改變AhR配體的I相代謝產物的的水溶性，使其易于排出體外[3,28]。代謝的最終目的是去毒化，然而由于在I相代謝中更易生成強親電化合物，因此相比于II相代謝，I相代謝產物更有可能形成具有毒性的活性中間物，其易于同細胞大分子發生親核取代[29]。2,3,7,8-TCDD等具有高毒性的二噁英類化合物極難被代謝，較長的半衰期使其能持續地激活AhR，從而產生一系列相關的毒性效應。

2.1 AhR配體的I相和II相代謝

I相代謝酶CYP是AhR激動劑( AhR agonist)主要的代謝酶，可能的II代謝酶包括了谷胱甘肽轉移酶、葡萄糖苷酸/硫酸根綴合酶，外源AhR激活劑的暴露通常能夠引起CYP1家族CYP1A1和CYP1A2的協同表達，但Yuan等發現，在苯并[α]芘暴露下，也能引起稀有鮈鯽CYP2Y3的表達[30]。在AhR激動劑中，PAHs屬于易于體內代謝的AhR激動劑，CYP1A1通常被認為是其主要代謝酶[3]。PAHs的毒性同樣依賴I相代謝，其代謝活化產物才是最終的致癌劑。例如，苯并[α]芘的一種I相代謝活化產物( +)苯并[α]芘-7,8-二醇-9,10環氧物-2被認為是最活潑的致癌劑[31]。二噁英類主要被CYP1A1和CYP1A2代謝，但體內代謝過程極難進行，因此區別CYP1家族這兩種酶對不同AhR激動劑的代謝活性和產物，是先前研究的關注點。Hu等[32]利用3-MC誘導SD大鼠，獲得了具有CYP1A1和CYP1A2活性的SD大鼠S9餾分，實驗期間通過在S9餾分中加入呋拉茶堿抑制CYP1A2活性來控制變量。該研究表明絕大多數的1-CDD和1,2,3,4-TCDD能夠被CYP1A1所代謝，而2,3,7,8-TCDD和1,2,3,7,8-PCDD主要被CYP1A1所氧化。Sakaki等[33]構建了兩種能夠分別表達CYP1A1和CYP1A2酵母細胞，并研究了二噁英類的代謝過程。研究發現在酵母體內表達的CYP1A1和CYP1A2都能夠引起2,7-diCDD和2,3,7-triCDD代謝，而CYP1A1和CYP1A2對2,3,7-trichloroDD所產生的代謝產物是不同的，CYP1A1主要的代謝產物為8-hydroxoy-2,3,7-TriCDD，而CYP1A2代謝產物更有可能是2,3,7-TriCDD的氯取代位點的羥基化產物。這些研究可能暗示CYP1家族這兩種酶在結構上的細微差異導致的酶作用機理是不同的，并對其代謝的化合物具有一定的選擇性。但與PAHs等其他AhR激動劑不同，PCDDs的I相代謝產物毒性相比于母體化合物顯著降低，例如2,3,7,8-TCDD的一種I相代謝產物8-羥基-2,3,7-TCDD,與AhR結合能力只相當于母體的10%[34]。

AhR激動劑的I相代謝產物可被多種II相代謝酶參與進一步修飾，包括了谷胱甘肽轉移酶(PCBs[35])、葡萄糖苷酸/硫酸根綴合酶(1,2,7,8-TCDD[36])等。II代謝酶對于AhR激動劑的I相代謝產物可能也具有選擇性，例如谷胱甘肽轉移酶主要針對于PCBs的I相代謝產物, 但目前還沒有發現谷胱甘肽轉移酶代謝能對PCDDs的I相代謝產物發生作用[3,34]。

2.2PCDDs的I相代謝模型

PCDDs的高毒性和代謝穩定性阻礙了對其代謝過程的研究。高毒性限制了PCDDs在模式動物中的暴露量，代謝穩定使其在先前的研究中很難得到達到儀器檢測限濃度的代謝產物。盡管如此，當前的研究已表明了PCDDs的四種主要的I相代謝模型，分別是：

1. 在PCDDs的非取代位點的羥基化反應[37];

2. 在PCDDs的氯取代位點的羥基化反應[38];

3. 在二噁英環的灣區發生的開環反應[39];

4. 伴隨著氯代位點轉移的羥基化反應，也被稱為NIH轉移(NIHshift)[40]。

活體和離體代謝動力學研究已表明了一些可能的PCDDs代謝規律，例如高氯代的PCDDs(OCDD)相比于低氯代的PCDDs(1,2,3,7,8-PeCDD)更難被代謝[36]，因此Birnbaum和Couture認為C-H鍵對于代謝酶氧化過程是必須的[41]。這一代謝規律也被進一步驗證，同時又有一些在離體實驗中的證據顯示相比于CYP1A1，CYP1A2更傾向于對高氯代的PCDDs(2,3,7,8-TCDD和1,2,4,7,8-PeCDD)的代謝[32]。然而這些規律并不能很好的解釋2,3,7,8-TCDD所具有的強代謝穩定性。

2.3 2,3,7,8-TCDD的代謝穩定性

2,3,7,8-TCDD代謝反應更容易發生在二噁英環的灣區，并發生開環反應[39]。Suzuki[42]的量子化學分子動力學研究表明，當O2分子在高溫( 472.15K)條件下作為氧化劑對2,3,7,8-TCDD發生氧化反應時，該化合物的在二噁英環灣區的C11-C12或C13-C14處更易于被活性氧氧化形成過氧化物，引發隨后的開環和降解反應，并推斷出PCDDs的穩定性主要跟其結構，能級和電子狀態有關。

在生物體內的，2,3,7,8-TCDD代謝過程也是也更易于在二噁英環的灣區發生過氧化反應，CYP酶介導了該反應的發生，在整個反應中，結合了底物的CYPs通過NADPH-細胞色素P450還原酶，分兩次接受來自NADPH所提供的共兩個電子，與氧分子作用形成了酶-底物-H2O2三元復合物。該復合物在一定條件下裂解O-O鍵，轉移了一個活性氧原子至底物，并發生歧化反應，形成氧化產物[3,24]。CYP酶的作用機制要求底物與CYP酶必須互相結合，因此CYP酶的空間結構可能影響了PCDDs的降解。現有的一些實驗也證實了這種可能性的存在。Shinkyo等[33]以先前實驗中證實的CYP1A1與2,3,7,8-TCDD形成結合為依據，假設若放大了大鼠CYP1A1的底物結合口袋的空間后，可以進一步增加該酶對2,3,7,8-TCDD的代謝活性，通過對定點突變技術在酵母細胞內表達CYP1A1及其突變酶，發現在該酶第240位氨基酸殘基在對底物的識別具有重要的作用，得到的F240A酶能夠代謝2,3,7,8-TCDD使其在氯取代位點發生羥基化作用，生成8-羥基-2,3,7-TCDD。盡管該突變酶對2,3,7,8-TCDD的代謝模式同二噁英環的灣區的開環反應有區別[39]，但使我們認識到，PCDDs的難降解與酶的底物結合口袋空間結構有直接關系。而先前有關于CYP1A1酶對PAHs代謝的研究也認為，PAHs的分子維度同CYP1A1假定的底物進口通道的空間大小可能直接影響著代謝速率的快慢,例如苯并[α]芘比苯并[e]芘更容易代謝的原因在于前者分子維度更小更容易進入假定的底物進口通道[43]。

3 二噁英類的毒性評價方法

聯合毒性評估中常用的毒性當量因子( toxic equivalency factors, TEF)法是對二噁英類進行毒性評價的主要方法[44]，其主要的目的在于以一個統一的標準來對二噁英類這類化合物進行健康風險評價并對其加以監管控制。TEF法參考的毒性數據本身并不能表征二噁英類所造成的毒性和生物學效應，只是AhR激動劑對CYPs的應激，主要包括兩個終點[45]：二噁英類同AhR的親和程度和其對P4501A1的誘導能力。通過上述對AhR激動劑受體作用機理的認識，這兩個終點均可以間接地表征二噁英類毒性大小。需要強調的是：TEF方法參考的活體實驗的毒性數據是通過模式動物口服攝入二噁英類的來獲得，只能外推應用于例如以飲食攝入為途徑的人體健康風險評價，所以直接應用TEF法對土壤、沉積物和飛灰中各種二噁英類進行潛在的健康風險評價的做法原則上并不正確[45]。但是TEF制定專家組認可利用TEF法計算這些環境基質中二噁英類的總毒性當量(toxic equivalent quantity, TEQ)，并以此來表征二噁英類在這些環境基質中整體污染程度。

TEF方法目前共有兩套標準，分別是1989年EPA公布的國際毒性當量因子(I-TEF)和2005年世界衛生組織(WHO)重新修訂的WHO2005-TEF。TEF法以2,3,7,8-TCDD作為指標化合物(index chemical)，并將其TEF數值定義為1，以多次離體或活體實驗中所得到二噁英類相對毒性當量(relative potency, ReP)數據為基礎，并經過專家組判定從而確定其他不同二噁英類毒性歸一化為2,3,7,8-TCDD的毒性大小。通過化學分析方法獲得樣品中數種二噁英類同系物濃度，再應用TEF法獲得樣品的TEQ。

TEF法是基于聯合毒性中的劑量加合模型(dose additive model, CA)，這一模型的成立基于以多種假設，包括：二噁英同系物或結構類似物應當具有類似的濃度修飾(toxicokinetic, TK)與效應修飾(toxicodynamic, TD)方式，此外還具有相類似的劑量-效應曲線形狀。 顯然，這些假設條件是很難全部達到的，顯示了毒性當量因子法的局限性[45]。 但是從整體來看,大部分毒性數據能夠較好的驗證劑量加合模型[46-48]，方法簡單易行，TEF法因此得到了廣泛的認可和應用。

4 基于毒性作用機理的二噁英類生物檢測方法

由于二噁英類在環境介質中含量極低，其濃度檢測主要依靠儀器分析方法。目前，高分辨色質譜方法仍然是二噁英類污染濃度檢測的“金標準(Golden Standard)”[49]。儀器分析方法過程繁瑣、檢測周期長、價格昂貴，不利于開展二噁英類污染的普查或大樣本量的常規監測。同時，TEF方法中得到的毒性當量同樣來自對AhR激動劑活性的實驗評估,因此對環境樣品TEQ的估算可以直接通過生物檢測方法獲得。

二噁英類生物檢測方法的原理基于對AhR及其信號通路的認識，以2,3,7,8-TCDD為例，其與AhR介導的P450酶系的表達過程存在著多種定量關系，是各種二噁英類生物檢測定量的基礎。這些定量關系包括：(1)CYP1A1表達量與2,3,7,8-TCDD暴露濃度的定量關系,(2)AhR: ARNT異源二聚體同DNA結合數量與2,3,7,8-TCDD暴露濃度定量關系。雖然AhR作用機制復雜，但是這兩種定量關系在多種二噁英類生物檢測方法中都體現出了較好的相關性。

4.1 基于離體細胞的生物檢測方法

EROD法：由于CYP1A1酶不能由肝細胞內源表達，且CYP1A1表達量與2,3,7,8-TCDD標準品的暴露濃度存在定量關系,表達的CYP1A1酶是脫乙氧基酶，能將7-乙氧基-3-異吩噁唑酮(thoxyresorufin, ERF)轉化生成熒光物質7-羥基-3-異吩噁唑酮(resorufin, RF)，正因為CYP1A1酶具有這種能力，其被稱為EROD酶(ethoxyresorufin-O-deethylase)，生成的RF是熒光劑，通過檢測熒光產物激發光的強度可以間接的獲得樣品中2,3,7,8-TCDD標準品濃度與熒光強度的劑量-效應關系[50]。高通量的EROD已建立在多種肝癌細胞系中[50-52]，其檢測限范圍在0.16-16 pm。雖然其他二噁英類按其TEF毒性大小換算引起的CYP1A1的表達量的定量關系并不完全等同于2,3,7,8-TCDD標準品的，但是仍然認為不同種類的的二噁英類毒性是可加的，即可以用一次環境樣品中測得的熒光強度通過2,3,7,8-TCDD標準的劑量效應換算得到2,3,7,8-TCDD的濃度，并用該濃度來表示該環境樣品的總毒性當量(EROD-TEQ)。然而，由ERF生成的RF熒光染料其熒光強度受pH和溫度共同影響[53]，同時RF只能溶解在揮發性極強的甲醇中才能防止在室內光線下淬滅[54]，這些因素制約著EROD法的應用。

CALUX法：CALUX法全稱是化學激活熒光素酶基因表達法(chemical-activated luciferase gene expression, CALUX)[55]，該方法同EROD方法相類似，其原理是構建含有二噁英應答元件(DRE)的蟲熒光素酶報告基因質粒，將該質粒轉染入肝癌細胞后,二噁英類不僅能通過AhR信號通路引起CYP1A1酶的表達，還能表達質粒中的蟲熒光素酶報告基因。通過裂解細胞并加入熒光底物后便可檢測熒光強度，且熒光強度同蟲熒光素酶濃度成正比。同EROD方法相比，因為CALUX法直接對表達的蟲熒光素酶進行檢測，該方法檢測靈敏度更高(0.033 pm左右)[56-57]，檢測時間更短，更適合于大量樣品的篩選和半定量測定。基于不同的離體細胞類型和質粒，已存在多種CALUX檢測系統[56-58]。CALFUX與CALUX不同的是以增強的綠色熒光蛋白(EGFP)作為報告基因，該檢測方法不需要裂解細胞和熒光底物，能夠直接在活細胞中測得表達的EGFP的熒光強度，是一種更為方便的檢測方法[59]，但是EGFP的降解半衰期為24h[60]，遠高于蟲熒光素酶的3h，因此在CALFUX的應用中，凈化后樣品殘留的PAHs能夠引起EGFP的表達并在短時間內不被降解，這可能直接影響CALFUX法短期暴露檢測結果[61]。

重組基因酵母檢測法:重組基因酵母法是在酵母中構建AhR表達系統，通過GAL1/10雙向啟動子同時表達人或小鼠的AhR和ARNT，并轉入含有二噁英應答原件( DRE)的β-半乳糖甘酶報告基因質粒[62-63]。相比于離體細胞的生物檢測方法，重組基因酵母檢測法有具有一些優勢。酵母不但易于培養，檢測成本低廉，并且酵母作為真核生物，相比原核生物，具有更為復雜的表達調控機制，例如酵母菌能夠進行簡單的蛋白質翻譯后修飾[64]。與哺乳動物細胞相比，最大的不同在于酵母本身并不內源表達AhR，并缺少一些復雜的代謝功能，因此對于酵母檢測系統來說，本身的背景是十分“干凈”的[65]。相較于哺乳動物細胞檢測系統，酵母檢測系統對于二噁英類檢測限較高，這主要有兩方面原因造成，一方面，酵母的細胞壁會對二噁英類等疏水性物質有部分阻礙，但相關研究也表明酵母細胞壁存在對疏水性物質的轉運通道；另一方面，酵母培養基同細胞培養基相比，缺乏血清所提供蛋白和脂質成分，而二噁英類等親脂性物質主要通過血清中的低密度脂蛋白進行轉運[63]。

4.2 DNA結合分析

由于細胞內生成AhR:ARNT異源二聚體同DNA結合數量與2,3,7,8-TCDD暴露濃度定量關系，這種定量關系是DNA結合分析檢測樣品中二噁英類濃度的基礎。可以通過凝膠阻滯實驗[66]和PCR方法[67]來定量測定AhR:ARNT異源二聚體同DNA結合情況。凝膠阻滯實驗并不利于對二噁英類樣品的高通量檢測，而一些PCR方法具有高通量特性。例如AhRC PCRTM[67]，二噁英類化合物激活試劑盒中的AhR使其與含有二噁英相應元件的的DNA探針結合，而結合的AhR受體能被微量反應管表面捕獲，在反應管中洗去未于受體結合的DNA探針，對結合AhR受體的探針在PCR中進行擴增從而定量檢測出被激活的AhR的數量。一些基于DNA結合分析方法的二噁英類生物檢測利用新的技術不斷提高對二噁英的檢測靈敏度，例如納米金技術[68]，此方法通過引入納米金顆粒標記的含DRE核心序列的雙鏈核酸探針，同由二噁英類結合并活化的AhR結合，再與ARNT二聚化后結合DRE，形成AhR配體-AhR-ARNT-DRE復合物，在ARNT單克隆抗體的特異性捕獲下,該復合物被固定于固相載體上,最后利用Scanometric檢測方法得到二噁英類檢出濃度，由于納米金信號易于放大，該方法的檢測限是傳統生物法的100倍以下。

4.3 酶連免疫方法

二噁英的酶免疫分析是以抗體對抗原的特異性吸附為基礎的。酶免疫分析(EIA)法一般以二噁英(PCDD/Fs)為抗原，生產酶標記的鼠抗或兔抗，樣品中的二噁英可與酶標記的鼠抗或兔抗發生免疫反應，通過酶催化底物發光或顯色而定量[69]。二噁英類的酶免疫分析法進過不斷發展已越來越成熟。當前得到廣泛應用的高通量二噁英類酶免疫法主要有競爭性酶免疫分析法ELISA[70]，該方法是根據鼠單克隆抗體DD3與二噁英類特異性結合的特點而建立的競爭抑制酶免疫方法。使用酶競爭配合物辣根過氧化物酶(HRP)和樣品中二噁英類共同競爭有限的DD3抗體的特異性結合位點。并以一系列不同濃度的 2,3,7,8-TCDD為標準物質做出的劑量-效應曲線，計算出環境樣品中二噁英類的TEQ，該檢測方法中，螯合物的熒光強度與二噁英類的TEQ成反比。

5 二噁英類生物檢測法的應用

5.1 環境樣品中二噁英類快速篩查

樣品經過高效的前處理過程后，通過高通量二噁英類生物檢測可以得到與化學檢測方法相接近的分析結果。同化學檢測方法相類似，樣品前處理是二噁英類生物檢測的關鍵[71]，前處理的主要目的是去除影響生物檢測的干擾物質，包括了脂質和多環芳烴類等。現階段，針對樣品中二噁英類生物快速篩查，多種商品化的生物檢測技術都整合了完整的樣品前處理方法，并能夠分離PCBs和PCDD/Fs組分。雖然生物檢測方法已被廣泛的應用[72-73]，然而由于環境基質的復雜性，針對環境樣品的二惡英類生物篩查的結果往往并不理想。

為了驗證二噁英類生物檢測法和化學分析法結果的相關性，David等[74]采用XDS-CALUX法和高分辨色質譜法得到的結果同時進行比較，該研究先以EPA SITE研究提供的209 SITE土壤和沉積物樣品為檢測樣品，發現整體樣本中CALUX-TEQ是GC/MS-TEQ的9.4倍，利用廣義估計方程(GEE)建立了CALUX-TEQ與GC/MS-TEQ數學模型，模型R2=0.892，斜率接近1而截距不為零，表明兩個檢測結果間有強相關性，得到的模型再對36個土壤和8個飛灰獨立樣品的CALUX-TEQ對應的GC/MS-TEQ進行預測。模型對于二噁英類中濃度的土壤樣品(1～3000 pg·g-1)預測具有較好的結果，這個范圍內模型整體預測TEQ值是GC/MS-TEQ的1.22倍，生物檢測與化學分析結果相接近。

很多研究都表明，針對于環境樣品，生物檢測法得到總毒性當量要遠大于化學分析方法的結果[75-76]，而針對于GC/MS-TEQ小于CALUX-TEQ原因，David等也在數據上進行了探究，首先按WHO推薦的17種二噁英類同系物的TEF計算得到樣品總的毒性當量WHO-TEQ，而后采用CALUX法得到二噁英類同系物的REP來計算校正的總毒性當量Adjusted-TEQ。計算得到42個土壤和沉積物樣品整體的Adjusted-TEQ是WHO-TEQ整體的1.5倍作用，這一結果表明，CALUX-TEQ大于GC/MS-TEQ的部分原因是由于WHO的TEF和CALUX法得到的REP不對應所造成的。為了更完整的探究生物檢測和化學分析結果的不匹配性，Amy[77]等利用GC-HRMS和GC×GC-TOFMS驗證了樣品前處理方法對生物檢測結果的影響。GC-HRMS被用來驗證目標化合物二噁英類是否能夠完全進入最終的檢測組分，而結合TOFMS的二維色譜用來驗證其他進入檢測組分的干擾物。GC-HRMS檢測的結果表明，簡化的樣品前處理方法能夠使絕大多數的目標化合物進入檢測組分，而GC×GC-TOFMS的結果表明前處理方法不能完全去除生物檢測干擾物質，例如PAHs和脂肪族化合物，而其他的一些研究表明這些干擾物還包括了PBDD/Fs，PBDE等[49]。盡管生物檢測方法對二噁英類具有極高的靈敏度，但是前處理過程未完全去除的干擾物質可能降低了生物檢測的可靠性。

針對環境樣品二噁英類檢測的生物檢測技術更應當定位成一種生物篩查手段，主要目的是在降低檢測成本和減少檢測時間條件下對數量龐大的環境樣品獲得相對準確的檢測結果。這些結果包括以閥值的概念來判斷二噁英類污染和以生物毒性大小的來辨別二噁英類污染的嚴重程度。

5.2 以AhR效應為終點毒性檢測

環境污染物中，能夠激活AhR信號通路的激動劑不僅僅包括了二噁英類，還包括了PAHs、PBDDs、PBDEs等幾大類已知或未知的化合物，盡管這些化合物最終的生物學和毒性效應不盡相同，但其部分在體內代謝活化的激活是通過AhR介導的，能夠不同程度上激活AhR信號通路。因此對針對這些物質的環境污染物篩查和風險評價，AhR效應仍然是一個很重要的檢測終點，通過適當的改變樣品前處理方法、分離和檢測條件，便可以方便地對不同類型AhR激動劑進行檢測，表征這些化合物或檢測組分中所具有的AhR效應大小。

伴隨著工業化的發展，大量人工合成有機化合物和伴隨的工業副產物被不斷的排入環境中，這些化合物的潛在毒性對整個生態系統構成了巨大風險。具Richard Judson等統計[78]，至少約2/3的化合物具有一定的危害信息，而僅有1/4的化合物具有詳細的毒理學數據。以化合物毒性數據建立起的環境基準對于監管這些化合物的使用和排放具有重要意義。然而這些化合物在環境中含量低，且單體分離困難，很難獲得高劑量的樣品直接進行活體實驗。作為一種高通量的離體生物毒性篩查手段，二噁英類生物檢測法能夠在較低劑量下快速靈敏的篩選出具有AhR效應的環境污染物。表1總結各類二噁英類生物檢測方法對潛在AhR效應化合物的篩查結果。表中不同的AhR效應化合物的毒性被以相對毒性效應(REP)或半最大效應濃度(EC50)表示，部分數據已被用來評價該類化合物的在環境中整體的污染狀況。

表1 高通量生物檢測方法對潛在芳香烴受體效應化合物的篩查

二噁英類生物檢測方法同樣能夠對污染環境整體的AhR激動劑水平進行評價，從而篩選和甄別這一大類污染物的高風險區[83-87]。如果能夠與同步開展的化學分析結合，就有可能甄別主要貢獻因子。這種因果關系分析工具(causative analysis)包括生物效應引導的污染物識別技術[88]，即Effect-Directed Analysis或Effect-directed Identification(EDA/EDI)，是常用來實現環境污染篩選和鑒定的方法。EDA始終以污染物的生物效應為導向，采用多級不同色譜選擇性的色譜對儲存液或上級色譜分離液生物篩選結果為陽性的組分進行分離和生物篩選，這樣通過不同特性的色譜分離將復雜的混合化學物分離出主要效應餾分，再對效應化合物進行定性和定量分析。這種以污染物AhR效應為導向的EDA技術已經應用于原油污染[89]、污水污染[90]、工業污染[91]等的環境調查中。W.Brack和K. Schirmer[91]采用EROD法，針對德國工業區沉積物污染樣品進行EDA分析，發現氧和硫雜環化合物是主要的芳香烴受體效應化合物。在EDA技術中，二噁英類生物檢測方法極大的縮短了生物效應的檢測難度，提高了檢測效率和靈敏度，同時以污染物的AhR效應為檢測終點的二噁英類生物檢測方法能夠方便的加入到多靶點的生物檢測流程中，同步檢測包括遺傳毒性、內分泌干擾效應和神經毒性等[92-94]，對污染物進行更加客觀和全面的評價。

6 展 望

AhR信號通路的復雜性使我們很難描繪完整而詳細的分子作用機制，原因在于針對幾個關鍵性問題我們仍然缺乏足夠的了解，例如AhR LBD是如何調控數量眾多且結構各異的內源或外源化合物以及AhR所參與的內源調控及其所產生的生物學效應。這需要我們進一步了解AhR結構信息來對AhR及其配體的作用行為進行預測，也需要進一步利用基因組學、代謝組學和蛋白組學等高通量數據來挖掘更為精細的AhR作用模式[95-96]，從而更完整的對二噁英類的毒性進行評價。

雖然基于各種原理開發的二噁英類生物檢測方法以得到了廣泛的應用,但針對環境樣品的二噁英類快速篩查，樣品前處理過程仍然占據著整個檢測過程的大部分時間。對復雜樣品中不同類型AhR激動劑進行分離是實現生物測試與化學分析結果可比的關鍵。盡管目前的商品化凈化柱縮短了一部分前處理時間，但是其仍然制約著生物檢測法高通量的發展方向。因此需要進一步展開對生物檢測方法的前處理流程研究，建立簡單、快速、經濟和相對準確的生物測試流程。同時，二噁英類生物檢測方法流程中的質量控制是提高檢測果可信度的重要途徑，但是目前還沒有成熟的生物檢測質量控制方法和標準，是二噁英生物檢測方法被環境部門采納應用中需要解決的關鍵問題。

[1] Safe S. Polychlorinated biphenyls (PCBs), dibenzo-p-dioxins (PCDDs), dibenzofurans (PCDFs), and related compounds: environmental and mechanistic considerations which support the development of toxic equivalency factors (TEFs) [J]. CRC Critical Reviews in Toxicology, 1990, 21(1): 51-88

[2] Denison M S, Soshilov A A, He G, et al. Exactly the same but different: Promiscuity and diversity in the molecular mechanisms of action of the aryl hydrocarbon (dioxin) receptor [J]. Toxicological Sciences, 2011, 124(1): 1-22

[3] Hu K, Bunce N J. Metabolism of polychlorinated dibenzo-p-dioxins and related dioxin-like compounds [J]. Journal of Toxicology and Environmental Health Part B: Critical Reviews, 1999, 2(2): 183-210

[4] 張保琴, 張海軍, 楊常青, 等. 2, 3, 7, 8-TCDD 的短期暴露對 HepG2 肝癌細胞內小分子代謝產物的影響 [J]. 生態毒理學報, 2012, 7(3): 292-298

Zhang B Q, Zhang H J, Yang C Q, et al. Effects of short-term exposure to 2, 3, 7, 8-TCDD on low-molecular metabolites in HepG2 cell [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2012, 7(3): 292-298 (in Chinese)

[5] 楊永濱, 鄭明輝, 劉征濤. 二惡英類毒理學研究新進展 [J]. 生態毒理學報, 2006, 1(2):105-115

Yang Y B, Zheng M H, Liu Z T. Researching advancement of the dioxins toxicology [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2006, 1(2): 105-115 (in Chinese)

[6] Kociba R, Schwetz B. Toxicity of 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) [J]. Drug metabolism reviews, 1982, 13(3): 387-406

[7] Connor K T, Aylward L L. Human response to dioxin: aryl hydrocarbon receptor (AhR) molecular structure, function, and dose-response data for enzyme induction indicate an impaired human AhR [J]. Journal of Toxicology and Environmental Health Part B: Critical Reviews, 2006, 9(2): 147-171

[8] Aylward L L, Brunet R C, Carrier G, et al. Concentration-dependent TCDD elimination kinetics in humans: toxicokinetic modeling for moderately to highly exposed adults from Seveso, Italy, and Vienna, Austria, and impact on dose estimates for the NIOSH cohort [J]. Journal of Exposure Science and Environmental Epidemiology, 2004, 15(1): 51-65

[9] Beischlag T V, Morales J L, Hollingshead B D, et al. The aryl hydrocarbon receptor complex and the control of gene expression [J]. Critical ReviewsTMin Eukaryotic Gene Expression, 2008, 18(3): 207-250

[10] Hankinson O. The aryl hydrocarbon receptor complex [J]. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 1995, 35(1): 307-340

[11] Denison M S, Nagy S R. Activation of the aryl hydrocarbon receptor by structurally diverse exogenous and endogenous chemicals [J]. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 2003, 43(1): 309-334

[12] Mcmillan B J, Bradfield C A. The aryl hydrocarbon receptor is activated by modified low-density lipoprotein [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007, 104(4): 1412-1417

[13] Denison M, Seidel S, Rogers W, et al. Natural and synthetic ligands for the Ah receptor [J]. Molecular Biology Approaches to Toxicology, 1998: 393-410

[14] Pandini A, Soshilov A A, Song Y, et al. Detection of the TCDD binding-fingerprint within the Ah receptor ligand binding domain by structurally driven mutagenesis and functional analysis [J]. Biochemistry, 2009, 48(25): 5972-5983

[15] Pandini A, Denison M S, Song Y, et al. Structural and functional characterization of the aryl hydrocarbon receptor ligand binding domain by homology modeling and mutational analysis [J]. Biochemistry, 2007, 46(3): 696-708

[16] Tian Y. Ah receptor and NF-κB interplay on the stage of epigenome [J]. Biochemical Pharmacology, 2009, 77(4): 670-680

[17] Ahmed S, Valen E, Sandelin A, et al. Dioxin increases the interaction between aryl hydrocarbon receptor and estrogen receptor alpha at human promoters [J]. Toxicological Sciences, 2009, 111(2): 254-266

[18] Hayden M S, Ghosh S. Shared principles in NF-κB signaling [J]. Cell, 2008, 132(3): 344-362

[19] Sheppard K A, Phelps K M, Williams A J, et al. Nuclear integration of glucocorticoid receptor and nuclear factor-kappaB signaling by CREB-binding protein and steroid receptor coactivator-1 [J]. The Journal of Biological Chemistry, 1998, 273(45): 29291-29294

[20] Ruegg J, Swedenborg E, Wahlstrom D, et al. The transcription factor aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator functions as an estrogen receptor beta-selective coactivator, and its recruitment to alternative pathways mediates antiestrogenic effects of dioxin [J]. Molecular Endocrinology, 2008, 22(2): 304-16

[21] Haarmann-Stemmann T, Bothe H, Abel J. Growth factors, cytokines and their receptors as downstream targets of arylhydrocarbon receptor (AhR) signaling pathways [J]. Biochemical Pharmacology, 2009, 77(4): 508-520

[22] Bunger M K, Moran S M, Glover E, et al. Resistance to 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin toxicity and abnormal liver development in mice carrying a mutation in the nuclear localization sequence of the aryl hydrocarbon receptor [J]. Journal of Biological Chemistry, 2003, 278(20): 17767-17774

[23] Okey A B. An aryl hydrocarbon receptor odyssey to the shores of toxicology: the Deichmann Lecture, International Congress of toxicology-XI [J]. Toxicological Sciences, 2007, 98(1): 5-38

[24] Rose R L, Hodgson E. Metabolism of Toxicants [M]. A Textbook of Modern Toxicology, 2004: 111

[25] Pollenz R S. The mechanism of AH receptor protein down-regulation (degradation) and its impact on AH receptor-mediated gene regulation [J]. Chemico-Biological Interactions, 2002, 141(1): 41-61

[26] Baba T, Mimura J, Gradin K, et al. Structure and expression of the Ah receptor repressor gene [J]. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(35): 33101-33110

[27] Michalek J E. Pharmacokinetics of TCDD in veterans ofoperation ranch hand: 10-year follow-up [J]. Journal of Toxicology and Environmental Health Part A, 1996, 47(3): 209-220

[28] Van Den Berg M, De Jongh J, Poiger H, et al. The toxicokinetics and metabolism of polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs) and dibenzofurans (PCDFs) and their relevance for toxicity [J]. CRC Critical Reviews in Toxicology, 1994, 24(1): 1-74

[29] Xu C, Li C Y T, Kong A N T. Induction of phase I, II and III drug metabolism/transport by xenobiotics [J]. Archives of pharmacal research, 2005, 28(3): 249-268

[30] Yuan L, Lv B, Zha J, et al. New cytochrome P450 1B1, 1C1, 2Aa, 2Y3, and 2K genes from Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus): Molecular characterization, basal expression and response of rare minnow CYP1s and CYP2s mRNA exposed to the AHR agonist benzo [a] pyrene [J]. Chemosphere, 2013, 93(2): 209-216

[31] Buening M, Wislocki P, Levin W, et al. Tumorigenicity of the optical enantiomers of the diastereomeric benzo [a] pyrene 7, 8-diol-9, 10-epoxides in newborn mice: exceptional activity of (+)-7beta, 8alpha-dihydroxy-9alpha, 10alpha-epoxy-7, 8, 9, 10-tetrahydrobenzo [a] pyrene [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1978, 75(11): 5358-5361

[32] Hu K, Bunce N J. Metabolism of polychlorinated dibenzo-p-dioxins by rat liver microsomes [J]. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology, 1999, 13(6): 307-315

[33] Sakaki T, Shinkyo R, Takita T, et al. Biodegradation of polychlorinated dibenzo-p-dioxins by recombinant yeast expressing rat CYP1A subfamily [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2002, 401(1): 91-98

[34] Shinkyo R, Sakaki T, Takita T, et al. Generation of 2, 3, 7, 8-TCDD-metabolizing enzyme by modifying rat CYP1A1 through site-directed mutagenesis [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2003, 308(3): 511-517

[35] Bakke J, Bergman A, Larsen G. Metabolism of 2, 4', 5-trichlorobiphenyl by the mercapturic acid pathway [J]. Science, 1982, 217(4560): 645-647

[36] Hakk H, Larsen G, Feil V. Tissue distribution, excretion, and metabolism of 1, 2, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in the rat [J]. Chemosphere, 2001, 42(8): 975-983

[37] Tulp M T M, Hutzinger O. Rat metabolism of polychlorinated dibenzo-p-dioxins [J]. Chemosphere, 1978, 7(9): 761-768

[38] Poiger H, Buser H-R, Weber H, et al. Structure elecidation of mammalian TCDD-metabolites [J]. Experientia, 1982, 38(4): 484-486

[39] Weber H, Poiger H, Schlatter C. Fate of 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin metabolites from dogs in rats [J]. Xenobiotica, 1982, 12(6): 353-357

[40] Petroske E, Huwe J, Feil V, et al. Identification of NIH-shifted metabolites of 1, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in the rat by NMR comparison with synthesized isomers [J]. Chemosphere, 1997, 34(5): 1549-1555

[41] Birnbaum L, Couture L. Disposition of octachlorodibenzo-p-dioxin (OCDD) in male rats [J]. Toxicology and applied pharmacology, 1988, 93(1): 22-30

[42] Suzuki A, Selvam P, Kusagaya T, et al. Chemical reaction dynamics of PeCB and TCDD decomposition: A tight-binding quantum chemical molecular dynamics study with first‐principles parameterization [J]. International Journal of Quantum Chemistry, 2005, 102(3): 318-327

[43] Lewis D, Ioannides C, Parke D. Molecular modelling of cytochrome CYP1A1: A putative access channel explains differences in induction potency between the isomers benzo (a) pyrene and benzo (e) pyrene, and 2-and 4-acetylaminofluorene [J]. Toxicology Letters, 1994, 71(3): 235-243

[44] Van Den Berg M, Birnbaum L S, Denison M, et al. The 2005 World Health Organization reevaluation of human and mammalian toxic equivalency factors for dioxins and dioxin-like compounds [J]. Toxicological Sciences, 2006, 93(2): 223-241

[45] Van Den Berg M, Birnbaum L, Bosveld A, et al. Toxic equivalency factors (TEFs) for PCBs, PCDDs, PCDFs for humans and wildlife [J]. Environmental Health Perspectives, 1998, 106(12): 775

[46] Walker N J, Crockett P W, Nyska A, et al. Dose-additive carcinogenicity of a defined mixture of “dioxin-like compounds” [J]. Environmental Health Perspectives, 2005, 113(1): 43

[47] Haws L C, Su S H, Harris M, et al. Development of a refined database of mammalian relative potency estimates for dioxin-like compounds [J]. Toxicological Sciences, 2006, 89(1): 4-30

[48] Tillitt D E, Ankley G T, Verbrugge D A, et al. H4IIE rat hepatoma cell bioassay-derived 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin equivalents in colonial fish-eating waterbird eggs from the Great Lakes [J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 1991, 21(1): 91-101

[49] Behnisch P A, Hosoe K, Sakai S I. Bioanalytical screening methods for dioxins and dioxin-like compounds—a review of bioassay/biomarker technology [J]. Environment International, 2001, 27(5): 413-439.

[50] Whyte J J, Jung R, Schmitt C, et al. Ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) activity in fish as a biomarker of chemical exposure [J]. CRC Critical Reviews in Toxicology, 2000, 30(4): 347-570

[51] Hahn M E. Biomarkers and bioassays for detecting dioxin-like compounds in the marine environment [J]. Science of The Total Environment, 2002, 289(1-3): 49-69

[52] Whyte J J, Schmitt C J, Tillitt D E. The H4IIE cell bioassay as an indicator of dioxin-like chemicals in wildlife and the environment [J]. Critical Reviews in Toxicology, 2004, 34(1): 1-83

[53] Ryder A G, Power S, Glynn T J. Fluorescence-Lifetime-Based pH Sensing Using Resorufin [C]. OPTO Ireland, 2003: 827-835

[54] Burke M D, Mayer R T. Ethoxyresorufin: Direct fluorimetric assay of a microsomal O-dealkylation which is preferentially inducible by 3-methylcholanthrene [J]. Drug Metabolism and Disposition, 1974, 2(6): 583-588

[55] Murk A, Legler J, Denison M, et al. Chemical-activated luciferase gene expression (CALUX): a novel in Vitro bioassay for Ah receptor active compounds in sediments and pore water [J]. Fundamental and Applied Toxicology, 1996, 33(1): 149-160

[56] Dindal A, Thompson E, Aume L, et al. Application of site-specific calibration data using the CALUX by XDS bioassay for dioxin-like chemicals in soil and sediment samples [J]. Environmental Science & Technology, 2007, 41(24): 8376-8382

[57] Scippo M L, Eppe G, De Pauw E, et al. DR-CALUX screening of food samples: evaluation of the quantitative approach to measure dioxin, furans and dioxin-like PCBs [J]. Talanta, 2004, 63(5): 1193-1202

[58] 汪暢, 王英, 雷垚, 等. 一株受二噁英類化合物誘導表達綠色熒光蛋白的胃癌細胞系的建立[J]. 生態毒理學報, 2008, 3(3): 244-249

Wang C, Wang Y, Lei Y, et al. The establishment of a gastric cancer cell line expressed enhanced green fluorescent protein (EGFP) induced by dioxin-like chemicals [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2008, 3(3): 244-249 (in Chinese)

[59] Nording M, Sporring S, Wiberg K, et al. Monitoring dioxins in food and feedstuffs using accelerated solvent extraction with a novel integrated carbon fractionation cell in combination with a CAFLUX bioassay [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2005, 381(7): 1472-1475

[60] Denison M S, Zhao B, Baston D S, et al. Recombinant cell bioassay systems for the detection and relative quantitation of halogenated dioxins and related chemicals [J]. Talanta, 2004, 63(5): 1123-1133

[61] Jin L, Gaus C, Van Mourik L, et al. Applicability of passive sampling to bioanalytical screening of bioaccumulative chemicals in marine wildlife [J]. Environmental Science & Technology, 2013, 47(14): 7982-7988

[62] Kawanishi M, Sakamoto M, Ito A, et al. Construction of reporter yeasts for mouse aryl hydrocarbon receptor ligand activity [J]. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2003, 540(1): 99-105

[63] Miller C A. Expression of the human aryl hydrocarbon receptor complex in yeast activation of transcription by indole compounds [J]. Journal of Biological Chemistry, 1997, 272(52): 32824-32829

[64] Miller III C A, Tan X, Wilson M, et al. Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays [J]. Plasmid, 2010, 63(2): 73-78

[65] Xu H, Luo F, Zhang J, et al. Development of a rapid screening and surveillance for estrogenic chemicals in environment based on recombinant yEGFP yeast cell [J]. Toxicology in Vitro, 2010, 24(4): 1285-1291

[66] Seidel S D, Li V, Winter G M, et al. Ah receptor-based chemical screening bioassays: Application and limitations for the detection of Ah receptor agonists [J]. Toxicological Sciences, 2000, 55(1): 107-115

[67] You F, Zhou Y F, Zhang X E, et al. Cell-free bioassay for measurement of dioxins based on fluorescence enhancement of fluorescein isothiocyanate-labeled DNA probe [J]. Analytical Chemistry, 2006, 78(20): 7138-7144

[68] 李柏生. 納米金技術檢測痕量二惡英類化合物的方法學研究 [D]. 華中科技大學, 2006

Li B S. Ultrasensitive colorimetric method to detect the dioxin-like chemicals by gold nanoparticles with silver enhancement [D]. Huazhong University of Science and Technology, 2006

[69] Samara F, Gullett B K, Harrison R O, et al. Determination of relative assay response factors for toxic chlorinated and brominated dioxins/furans using an enzyme immunoassay (EIA) and a chemically-activated luciferase gene expression cell bioassay (CALUX) [J]. Environment International, 2009, 35(3): 588-593

[70] Stanker L, Watkins B, Vanderlaan M, et al. Development of an immunoassay for chlorinated dioxins based on a monoclonal antibody and an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) [J]. Chemosphere, 1987, 16(8): 1635-1639

[71] 董亮, 王秀琴, 張烴, 等. 環境介質中有機污染物分析前處理方法概述[J]. 現代科學儀器, 2010, 10(5): 120-125

Dong L, Wang X Q, Zhang Q, et al. A review on preparation of organic pollutants in environmental samples analysis [J]. Modern Scientific Instruments, 2010, 10(5): 120-125

[72] Warner M, Eskenazi B, Patterson D G, et al. Dioxin-Like TEQ of women from the Seveso, Italy area by ID-HRGC/HRMS and CALUX [J]. Journal of Exposure Science and Environmental Epidemiology, 2004, 15(4): 310-318

[73] Li W, Wu W, Xu Y, et al. Measuring TCDD equivalents in environmental samples with the micro-EROD assay: Comparison with HRGC/HRMS data [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2002, 68(1): 111-117

[74] Brown D J, Orelien J, Gordon J D, et al. Mathematical model developed for environmental samples: Prediction of GC/MS dioxin TEQ from XDS-CALUX bioassay data [J]. Environmental Science & Technology, 2007, 41(12): 4354-4360

[75] Brown D, Kishimoto Y, Ikeno O, et al. Validation study for the use of the dioxin responsive CALUX TM assay for analysis of Japanese ash and soil samples [J]. Organohalogen Compounds, 2000, 45: 200-203

[76] Nording M, Denison M S, Baston D, et al. Analysis of dioxins in contaminated soils with the CALUX and CAFLUX bioassays, an immunoassay, and gas chromatography/high-resolution mass spectrometry [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2007, 26(6): 1122-1129

[77] Dindal A, Thompson E, Strozier E, et al. Application of GC-HRMS and GC×GC-TOFMS to aid in the understanding of a dioxin assay’s performance for soil and sediment samples [J]. Environmental Science & Technology, 2011, 45(24): 10501-10508

[78] Judson R, Richard A, Dix D J, et al. The toxicity data landscape for environmental chemicals [J]. Environmental Health Perspectives, 2009, 117(5): 685

[79] Behnisch P A, Hosoe K, Sakai S-I. Brominated dioxin-like compounds: in vitro assessment in comparison to classical dioxin-like compounds and other polyaromatic compounds [J]. Environment International, 2003, 29(6): 861-877

[80] Su G, Xia J, Liu H, et al. Dioxin-like potency of HO-and MeO-analogues of PBDEs’ the potential risk through consumption of fish from Eastern China [J]. Environmental Science & Technology, 2012, 46(19): 10781-10788

[81] Bláha L, Klánová J, Klán P, et al. Toxicity increases in ice containing monochlorophenols upon photolysis: Environmental consequences [J]. Environmental Science & Technology, 2004, 38(10): 2873-2878

[82] Horii Y, Khim J S, Higley E B, et al. Relative potencies of individual chlorinated and brominated polycyclic aromatic hydrocarbons for induction of aryl hydrocarbon receptor-mediated responses [J]. Environmental Science & Technology, 2009, 43(6): 2159-2165

[83] Ma M, Li J, Wang Z. Assessing the detoxication efficiencies of wastewater treatment processes using a battery of bioassays/biomarkers [J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 2005, 49(4): 480-487

[84] Qiao M, Chen Y, Zhang Q, et al. Identification of ah receptor agonists in sediment of meiliang bay, taihu lake, China [J]. Environmental Science & Technology, 2006, 40(5): 1415-1419

[85] Shen C, Huang S, Wang Z, et al. Identification of Ah receptor agonists in soil of e-waste recycling sites from Taizhou area in China [J]. Environmental Science & Technology, 2007, 42(1): 49-55

[86] 柯潤輝, 李劍, 許宜平, 等. 被動式采樣器與原位魚體暴露用于監測水體Ah受體效應的比較研究[J]. 生態毒理學報, 2006, 27(11): 2309-2313

Ke R H, Li J, Xu Y P, et al. Comparison of the methods for assessing Ah effects in aquatic system by semipermeable membrane device and caged fish [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2006, 27(11): 2309-2313(in Chinese)

[87] 喬敏, 黃圣彪, 朱永官, 等. 太湖梅梁灣沉積物中多環芳烴的生態和健康風險 [J]. 生態毒理學報. 2008, 2(4): 456-463

Qiao M, Huang S B, Zhu Y G, et al. Ecological risk assessment of polycyclic aromatic hydrocarbons in sediments of Meiliang bay, Taihu Lake [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2008, 2(4): 456-463 (in Chinese)

[88] 曲廣波, 史建波, 江桂斌. 效應引導的污染物分析與識別方法 [J]. 化學進展, 2011, 23(11): 2389-2398

Qu G B, Shi J B, Jiang G B. Development and application of effect-directed analysis in environmental research, 2011, 23(11): 2389-2398(in Chinese)

[89] Radovic J R, Thomas K V, Parastar H, et al. Chemometrics-assisted effect-directed analysis of crude and refined oil using comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry [J]. Environmental Science & Technology, 2014, 48(5): 3074-3083

[90] Barceló D. Effect-directed analysis of key toxicants in European river basins. a review [J]. Environmental Science and Pollution Research-International, 2007, 14(1): 30-38

[91] Kaisarevic S, Varel U L V, Orcic D, et al. Effect-directed analysis of contaminated sediment from the wastewater canal in Pancevo industrial area, Serbia [J]. Chemosphere, 2009, 77(7): 907-913

[92] Van Der Linden S C, Heringa M B, Man H Y, et al. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents and surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays [J]. Environmental Science & Technology, 2008, 42(15): 5814-5820

[93] Brack W. Effect-directed analysis: A promising tool for the identification of organic toxicants in complex mixtures? [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2003, 377(3): 397-407

[94] Brack W, Schmitt-Jansen M, Machala M, et al. How to confirm identified toxicants in effect-directed analysis[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008, 390(8): 1959-1973

[95] 端正花, 朱琳. 生態毒理基因組學——后基因組時代生態毒理學的新領域[J]. 生態毒理學報, 2007, 2(2): 138-141

Duan Z H, Zhu L. Ecotoxicogenomics-the new challenge of ecotoxicology in the post-genomic era [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2007, 2(2): 138-141(in Chinese)

[96] 梁雪芳, 查金苗, 程鋼, 等. 蛋白組學技術的發展及在水生態毒理學中的應用 [J]. 生態毒理學報, 2012, 7(1): 10-24

Liang X F, Zha J M, Cheng G, et al. Development and application of proteomic technologies in aquatic toxicology [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2012, 7(1): 10-24 (in Chinese)

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Review on the Toxic Mechanisms and Bioassay Approaches for Dioxin-like Compounds

Huang Chao1, Chen Ning1,2, Yang Mingjia1,*, Feng Zhongfu3, Ma Mei1, Wang Zijian1

1. Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Beijing 100085 2. Anhui Academy of Environmental Science, Hefei 230071 3. Bonna-Agela Technologies Inc, Tianjin 300462

Received 1 July 2014 accepted 27 July 2014

The toxic dioxin-like compounds are typical representatives of persistent organic pollutants (POPs). They have a variety of sources and are attracted widespread attention. In past years, some congeners of dioxins and furans were thought metabolically stable in biota, and their toxic effects were mainly mediated through aryl hydrocarbon receptor (AhR). Recent research demonstrated that the toxic mechanisms of these AhR agonistic compounds should be more complicate then previously recognized. Based on recent research progress, this review article presents some new insights into the toxic modes of action (MoA) and metabolic pathways. Also, high-throughput bioassay approaches developed based on MoA were summarized for the sake of screening and risk assessment of dioxin-like compounds in environmental media.

Dioxin-like compounds; AhR; mechanism of toxicity; metabolism; bioassay

環保公益性行業科研專項(No. 201209016)；國家自然科學基金青年基金(No. 21107131)；國家高技術研究發展計劃項目(No. 2011AA060603)；國家高技術研究發展計劃項目(No. 2014AA06A506)

黃超(1989-)，男，碩士，主要研究方向為水生態毒理學, Email: hch-app@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: avanotice@163.com

10.7524/AJE.1673-5897-20140701001

2014-07-01 錄用日期：2014-07-27

1673-5897(2015)3-050-13

X171.5

A

楊明嘉(1981—)，女，博士，助理研究員，主要研究方向為水生態毒理學。

黃超，陳凝，楊明嘉, 等. 遼東半島海域魚貝中有機氯農藥殘留及其風險評估[J]. 生態毒理學報，2015, 10(3): 50-62

Huang C, Chen N, Yang M J, et al. Review on the toxic mechanisms and bioassay approaches for dioxin-like compounds [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 50-62 (in Chinese)