彗星試驗技術在水生與土壤環境中的毒理學應用

卞方杰，邢美燕，楊健，孫文，潘賽

污染控制與資源化研究國家重點實驗室，長江水環境教育部重點實驗室，同濟大學，上海 200092

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彗星試驗技術在水生與土壤環境中的毒理學應用

卞方杰，邢美燕*，楊健，孫文，潘賽

污染控制與資源化研究國家重點實驗室，長江水環境教育部重點實驗室，同濟大學，上海 200092

彗星試驗是一種檢測真核細胞脫氧核糖核酸(DNA)損傷的技術，快速、低成本、適用于幾乎所有真核細胞，因此常應用于遺傳毒理學、輻射生物學、腫瘤細胞學、毒性檢測等方面。尤其以靈敏度高、檢測聯合毒性的特點大量運用于環境研究中。主要介紹彗星試驗方法學發展歷程，彗星試驗的原理及其在環境領域中的應用，并指出應用中的受限因素以及未來的發展前景，為今后進一步推廣該試驗技術提供理論上的指導與參考。

彗星試驗；遺傳毒性；DNA損傷；污染評價；生物檢測

近年來，隨著經濟的迅猛發展，我國的生態環境也承受著前所未有的風險。大量的污染事件頻繁暴發，昭示著環境的脆弱。同時各類新興污染物不斷曝光，逐漸引起學者與公眾的關注，如環境內分泌干擾物(EDCs)，持久性有機污染物(POPs)，有機磷阻燃劑(OPFRs)，溴代阻燃劑(BFRs)等。而在對這些污染物的深入研究中，人們越來越多地把目光聚集到毒理方面，并致力于定性定量評估這些物質對生態環境，對生物體造成的毒性效應。

在環境科學領域，細胞和分子水平的診斷技術，如DNA損傷檢測技術，由于其特異性和實用性等優點，在污染評價與生物檢測方面異軍突起。外界環境中的理化因素對細胞脫氧核糖核酸(DNA)的損傷是引起基因突變和癌變的主要原因，因此判斷細胞DNA是否損傷是環境監測中重要的一環。彗星試驗(comet assay)又稱單細胞凝膠電泳試驗(single cell gel electrophoresis，SCGE或SCG)，是一種檢測真核細胞DNA損傷的常用方法。該方法可以對遺傳毒性物質產生的多種DNA損傷(單鏈斷裂、雙鏈斷裂等)進行定性和半定量的檢測。同時該技術具有檢測敏感性高，樣品所需細胞數量少，靈活低成本，試驗周期短等特點。近些年來，該方法廣泛應用于遺傳毒理、環境監測和細胞凋亡等研究，其中在健康風險評估中的應用已成為目前研究的焦點。關于彗星試驗的文章多立足于技術上的應用，鮮有關于彗星試驗方法學發展歷程的概述，也未有從大環境的宏觀角度進行綜述，所以本文從彗星試驗方法學發展展開，介紹試驗原理及其在水生環境、土壤環境中的應用，也指出該方法一定的局限性與發展空間，旨在為進一步推廣該技術提供參考與指導。

1 彗星試驗方法學發展歷程(Methodologicaldevelopment of comet assay)

1.1 國際研究者對彗星試驗方法學的探究

1984年Ostling和Johanson[1]首次提出電泳pH9.5情況下的彗星試驗版本，當時認為彗尾是DNA超螺旋的釋放，現在的研究表明其實是一些緊密的DNA環在電泳下形成的光圈。

1988年，Singh等[2]對試驗過程進行改良，主要是將電泳過程中的pH提高至13，在此版本下可以檢測到DNA單鏈損傷(SSB)、ALS(堿性易變位點)、DNA-DNA交聯、DNA-蛋白質交聯和與SSB相關的修復。該版本得到很多國際組織的認可，成為經典版本。

1995年，ICAW(The International Comet Assay Workshop)在第二屆ICEM研討會(International Conference on Environmental Mutagens)上成立，每兩年一屆，至今已舉辦10次(10thICAW，Porto，Portugal，16-17Sep 2013)，是彗星試驗領域最全面，最專業的研討會，每屆會議上都會討論關于彗星試驗理論、實踐方面的研究進展和這項技術的最新應用。

1999年，IWGT(國際基因毒性檢測課題組)專家達成共識，認為1988年Singh的堿性檢測版本是最佳版本，并概括了其成本低，試驗周期短，靈活敏感的特點，同時討論了試驗中操作步驟對應的機理，如何在載玻片上鋪膠，以及細胞毒性在結果中難以顯示清楚等問題[3]。

2005年，第四屆IWGT研討會召開，期間召集專家組成彗星試驗專家組，討論了多劑量與單一劑量，不同的細胞提取方式，細胞毒性，不同的圖像分析系統對試驗結果的影響[4]。

2010年，歐洲彗星試驗組織ECVAG成立，該組織的研究重點是研究彗星試驗中DNA損傷和修復的差異性。通過研究表明，在用彗星試驗檢測DNA損傷和FPG(甲酰嘧啶)敏感位點時，不同試驗室的差異很大，但是濃度和損傷的關系在每個試驗室中都可以檢測到。此外，不同數據分析系統帶來的影響遠大于試驗操作規范不同的影響，同時ECVAG也在向制定國際統一的彗星試驗操作規范而努力[5]。

2011年，第八屆研討會上由Andrew Collin等領軍人物提出建立運用彗星試驗對人體進行生物監測的計劃，并在第九屆會議上得以確定為“ComNet”計劃，并成立專門的網站(www.comnetproject.org)來收集數據[6]。這些系列研討會為彗星試驗的深入探究及推廣做出了相當大的貢獻。

1.2 國內研究者對彗星試驗方法學的發展

國內早期對彗星試驗的研究主要包括引用介紹、研究應用、方法改進三個方面。20世紀末國內開始出現了大量關于單細胞凝膠電泳技術的介紹[7-8]，隨后該方法被陸續用于癌細胞研究、人血淋巴細胞研究、細胞凋亡研究、毒性檢測等領域。

四川大學張遵真教授及其課題組在彗星試驗技術的探索與推廣方面做了大量工作，是國內本領域的領軍力量。曾就彗星試驗裂解時間、解旋時間、電壓電流等進行篩選，尋求最優化實驗條件[9]。也對傳統染毒、懸浮染毒兩種染毒方式進行了對比，提出了懸浮染毒更敏感，節約細胞與時間，均勻性好的結論，建議作為哺乳動物細胞的首選染毒方式[10]。此外，他們還建立了一種非熒光染色的實驗方法：銀染法。該方法具有染色清晰，敏感性高，可直接用光學顯微鏡觀察的特點，促進了彗星試驗的進一步推廣[11]。

在實驗操作步驟方面，牛勇等[12]研究了乙醇脫水干燥法保存膠片的穩定性及系統性。羅明志等[13]對制膠，水洗，電源選擇和脫水等主要實驗步驟進行了改進。劉豐等[14]對制膠方法稍加改良，使之可處理大批量的樣品。歐紅梅等[15]對彗星試驗的國際聯合驗證進行了詳細介紹，從給藥方案設計、取樣等6個方面闡述了較公認的體內彗星試驗方法，具有較重要的借鑒意義。

國內研究者針對不同實驗對象也確立了不同的實驗方案。徐海娟等[16]采用大鼠微量全血法代替傳統的分離-富集法，使實驗方法更簡單，便于大規模的檢測工作。魯志松等[17]針對人體頰黏膜細胞彗星實驗探討了最適條件。陳建偉等[18]建立了雙尾彗星試驗法來檢測精子的DNA完整性。這些不同方法學的建立表明了彗星試驗技術已得到國內研究者們的繼承與發展。

閆學昆等[19]對彗星試驗圖像采用的傳統迭代閾值分割法進行改進，并推廣至雙閾值分析法。該方法快速，可靠，分割效果理想，并可實現圖像的自動分割。這是國內少有的對彗星試驗圖像分析系統的改良，為提高不同實驗室之間結果的可比性做出了較大貢獻。

國內多年來對彗星試驗的發展主要集中在實驗步驟與條件優化方面，涉及機理較少，但我們看到該技術已慢慢得到研究者的認同與青睞，且在各領域得到大量應用，前景可觀。

2 彗星試驗在環境領域的應用(Applications ofcomet assay in the environmental field)

2.1 彗星試驗的原理

彗星試驗是通過將細胞懸浮液固定在載玻片上的瓊脂糖里，浸泡在高鹽分、高堿度的裂解液里裂解細胞膜，排出細胞質，使DNA緊密的超螺旋結構裸露，繼而在之后的過程中解旋開來，損傷的DNA片段暴露出負電荷，并在電泳時向陽極遷移，形成“彗尾”，而完整的DNA沒有遷移，形成“彗核”，再通過染色和顯微拍照記錄。通過尾長、尾矩、Oliver尾矩等指標來顯征DNA的損傷程度，且可以較好地表達污染物遺傳毒性的劑量-效應關系。

2.2 彗星試驗在環境領域的應用

彗星試驗最早應用于檢測電離輻射對DNA的損傷研究中，如今在基因毒性測試[20]、人體研究[21]、DNA修復測試[22]等領域均有很廣泛的研究。而隨著環境領域方面的研究越來越多，越來越深入，彗星試驗已經成為一項常用技術普遍用于污染物質的毒性檢測中。

2.2.1 水環境中的應用

水環境是構成環境的基本要素之一，是人類社會賴以生存和發展的重要場所，也是受人類干擾和破壞最嚴重的領域。水環境中污染物質種類復雜，衍生物繁多。通過原位取樣和實驗室模擬兩種方法，脊椎水生生物、無脊椎水生生物、水生植物彗星實驗都得到很廣泛的研究(表1)。

隨著研究的不斷深入，人們越來越多地關注利用水環境中的特定生物研究及評價新型污染物的基因毒性。例如利用貽貝研究煙草提取物[23]和內氯氰菊酯的濃度[24]。

其中，人類活動對水環境利用的起源便是河流水源與飲用水環節。Kolarevic[31]研究了復雜環境下彗星實驗參數與各種有機物以及環境之間的聯系。通過檢測貽貝血細胞彗星試驗參數，發現尾矩與水環境中鋅、溫度、溶解氧呈現很好的相關性。Alink[32]監測了1978-2005年近30年萊茵河河水對蔭魚的彗星實驗數據，為環保決策提供了有力的支撐。Rajaguru等[33]利用鯉魚、蚯蚓分別作為印度Noyyal河河水和底泥的毒性指示生物，研究了河流沿程毒性的變化情況，為海洋環境的綜合評價指標及風險評價體系提供了新方法及重要的手段。

檀麗[34]應用蠶豆根尖微核試驗、彗星試驗技術對8種代表性DBPs(消毒副產物)進行遺傳毒性評價，發現彗星試驗8種毒性損傷都可以檢測出，而微核試驗只檢測出5種，并且發現蠶豆根尖彗星試驗對5種鹵乙酸(HAAs，重要的消毒副產物)的檢出限比其他檢測系統要低。因此，在進行進一步的監測數據積累后，有望將該試驗用于飲水遺傳毒性原位監測。

在水環境毒性監測中更具意義的應用是用于廢水的檢測，尤其是工業廢水。隨著現代工業的迅速發展，實際水體和排放水體中的致癌物、難降解物質、重金屬等有毒物質的種類和含量大大增加，對環境影響很大。逐一檢測各個污染物的毒性和含量相當繁瑣且沒有必要。綜合毒性的測量手段應運而生，又以敏感度高，靈活快速的彗星試驗應用廣泛。

凌發忠等[35]對彗星試驗稍加改進后，利用嗜熱四膜蟲對醫藥工業廢水進行檢測，結果發現彗星試驗可以快速準確的檢測出各類醫藥廢水的毒性，相對其他化學分析法等有著不可替代的優勢。張遵真等[36]利用改良的彗星試驗對污水處理廠進出水、造紙廠、制革廠廢水進行檢測，總結了利用彗星試驗檢測工業廢水對DNA損傷的誘導性的特點：無需預處理，直接檢測；反映廢水里多種物質的聯合毒性作用，更具實際意義；可通過不同稀釋倍數的廢水毒性的檢測來大致確認廢水排出廠后的影響范圍。

表1 水環境中某些生物彗星試驗

2.2.2 土壤環境中的應用

環境保護部和國土資源部2014年發布了全國土壤污染狀況調查公報，調查結果顯示，全國土壤環境狀況總體不容樂觀，部分地區土壤污染較重，工礦業廢棄地土壤環境問題突出。重金屬、DDT等農藥、POPs、PAHs各種污染物引發的社會事件不斷出現。大量除草劑和殺蟲劑的使用，可能會影響非目標生物的生長，導致土壤的結構和功能生態系統的不可逆破壞[37]。土壤是一個復雜的釋義動態系統，對各類污染物調節作用不盡相同。因此取得當地土壤指示標志物顯得十分重要，而其中蚯蚓被認為是非常合適的陸地生物生態毒性測試的模型[38]。

蚯蚓根據不同的目的不僅被用作殺蟲劑、重金屬的指示標志物(表2)，而且在新型材料毒性檢測方面也有很廣泛的應用。Hu等[44]實驗室研究了多壁碳納米管及吸附材料五氯酚鈉對赤子愛勝蚓的毒性實驗，試圖說明兩種“捆綁”的化學物質的聯合毒性。Sforzini等[45]用人造土壤為基質背景，比較了微核試驗和彗星試驗在苯并[a]芘與四氯二苯并-p-二惡英不同濃度下的蚯蚓遺傳毒性。不同的原理以及數據信息來源，使得彗星試驗能夠與其他分子診斷技術聯合使用，更好的為環境決策做支撐。

植物彗星試驗是彗星試驗的另一重要分支，憑借更高的敏感性，樣本的選擇性更強，應用規模更廣的特點同樣得到了研究者的青睞，大量應用于土壤環境的毒性檢測。1996年Koppen[46]首次提出了植物彗星試驗的理念，隨后，國內外研究學者開始使用植物彗星試驗技術開創出一片新的毒性檢測領域。林愛軍等[47]采用了機械分離細胞核的方法分析了6種不同植物組織細胞進行彗星試驗的情況。曹玉偉等[48]對植物彗星試驗的細胞核分離方法，試驗操作進行了詳細介紹，同時較全面地綜述了其在生態毒理領域的應用及植物修復機制。

表2 土壤環境中彗星試驗應用研究

3 研究展望

彗星試驗是一種較為年輕的方法，潛力還沒有被完全發掘出來，在不久的將來也許能夠作為標準方法應用于環境生物毒性檢測。彗星試驗與染色體畸變試驗和微核試驗等技術聯合應用研究逐步受到研究者的關注[49]。此外研究者還嘗試利用FPG彗星試驗對膽固醇逆向轉運DNA損傷指示空氣顆粒物質危害[50-51]。

近些年科學家們對不同試驗室結果出現的差異化現象，活體內(in vivo)、活體外(in vitro)不同染毒方式的區別等方面投入了大量精力進行研究。Godschalk等[52]人通過對歐洲5個國家，12個不同試驗室對PBMC(外周血單核細胞)中的FPG(甲酰嘧啶)敏感位點和SB(DNA鏈損傷)進行比較，結果表明前者差異不大，而后者具有顯著性差異。此外還發現采用統一的細胞提取手段并不能降低各試驗室結果之間的差異性。這對2013年ECVAG的相關研究是進一步的印證[53]。而早在2009年Zainol等[54]也嘗試使用自制的標準化方法來降低試驗室之間試驗結果的差異性。

彗星試驗方法學的研究從自Ostling和Johanson首次提出彗星試驗后始終繼續著，常用的彗星試驗檢測的是一種綜合毒性，隨著應用越來越廣泛，試驗對象越來越復雜，不同的細胞，它的提取方式，試驗條件的控制都不同，雖然都能得到陰性或陽性的結果，濃度與結果的對應關系，但不同實驗室之間幾乎不能相互定量比較，這些都是試驗本身性質帶來的局限性。DNA損傷的原因和種類有很多，污染物及其大量衍生物本身會對DNA產生復合損傷，同時損傷的細胞會引發炎癥等癥狀產生二次損傷[55]，因此很難從結果去區別損傷類型或是研究作用機理。此外，圖像數據處理(IA)系統是影響試驗結果差異的重要因素，研發更準確，更有效的IA系統也是當務之急。

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The Toxicologic Applications of the Comet Assay in the Aquatic and Soil Environment

Bian Fangjie, Xing Meiyan*, Yang Jian, Sun Wen, Pan Sai

Key Laboratory of Yangtze River Water Environment Ministry of Education, State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, Tongji University, Shanghai 200092, China

Received 6 October 2014 accepted 12 November 2014

The comet assay is a rapid and cost-effective protocol of measuring deoxyribonucleic acid (DNA) damages, highly suitable for almost all eukaryotic cells. Therefore, it is widely used in the field of genetic toxicity, radiation biology, tumor cytology, toxicity detection etc., particularly with wide applications in environment researches due to its high sensitivity and detection of joint toxicity. This paper mainly reviews the development of the comet assay methodology, its experimental principles and applications in the aquatic and soil environment. More importantly, the limited factors and future prospects for the applications of comet assay in this paper are documented to provide a theoretical guidance and reference for popularizing the comet assay.

comet assay; genetic toxicity; DNA damage; pollution assessment; biological monitoring

中央高?；究蒲袠I務費專項資金(0400219187)

卞方杰(1991-), 男, 碩士, 研究方向為環境毒理學, E-mail: bfj222000@126.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: xmy5000@163.com

10.7524/AJE.1673-5897-20141006001

2014-10-06 錄用日期：2014-11-12

1673-5897(2015)3-063-08

X171.5

A

邢美燕(1977-)，女，同濟大學環境學院市政工程博士，副教授，主要研究方向為污水與廢水處理理論與資源化技術。

卞方杰, 邢美燕, 楊健, 等. 彗星試驗技術在水生與土壤環境中的毒理學應用[J]. 生態毒理學報, 2015, 10(3): 63-70

Bian F J, Xing M Y, Yang J, et al. The toxicologic applications of the comet assay in the aquatic and soil environment [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 63-70 (in Chinese)