雙酚A聯合鎘亞慢性染毒對未成年雌性小鼠生殖內分泌干擾作用

何慶峰，李宏，李燕杰，張平平，張愛琳，吳海清

1. 天津農學院食品科學與生物工程學院，天津，300384 2.福建衛生職業技術學院，福州，350101 3. 天津農學院計算機與信息工程學院，天津，300384

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雙酚A聯合鎘亞慢性染毒對未成年雌性小鼠生殖內分泌干擾作用

何慶峰1,*，李宏2，李燕杰3，張平平1，張愛琳1，吳海清1

1. 天津農學院食品科學與生物工程學院，天津，300384 2.福建衛生職業技術學院，福州，350101 3. 天津農學院計算機與信息工程學院，天津，300384

目前，針對雙酚A(BPA)或鎘(Cd)內分泌干擾毒性的研究很多，但是關于其聯合作用的研究則較少。將昆明雌性幼鼠分為4組，分別為對照組、BPA組、Cd組及聯合組，灌胃染毒5周，觀察小鼠動情周期、卵巢組織抗氧化水平、血清性激素及子宮內膜下層α亞型雌激素受體(ERα)免疫組化表達等指標的變化。結果發現，與對照組比較，各染毒組的動情周期均發生變化，體重、子宮系數、血清性激素水平及子宮內膜下層ERα表達降低(P<0.05)；BPA組及Cd組的 卵巢T-SOD及MDA水平與對照組比較無差異(P>0.05)，但聯合組的卵巢T-SOD及MDA水平顯著區別于對照組(P<0.05)；此外，聯合組的子宮內膜下層ERα陽性表達率(36%±11.7%)顯著低于BPA組及Cd組(P<0.05)。BPA及Cd對雌性生殖內分泌系統聯合作用毒性較各單劑量組增加，氧化損傷及影響ERα表達可能是聯合毒性作用機制之一。

雙酚A; 鎘; 聯合作用; 雌性; 生殖內分泌

環境內分泌干擾物(environmental endocrine disruptors, EEDs)是指能進入機體并干擾機體內分泌作用的環境污染物，其可通過結合雌激素受體的方式模擬雌激素樣作用，也被稱為環境雌激素[1]。雙酚A(bisphenol A, BPA)和重金屬鎘(cadmium, Cd)是兩種常見的EEDs，對人體健康造成多系統毒性。由于女性生殖內分泌關系到下一代的健康，BPA與Cd的雌性生殖內分泌毒性具有特殊的毒理學意義，已經逐漸引起了環境學家及毒理學家的重視，已有大量研究表明了BPA與Cd均具有雌性生殖內分泌毒性作用[2-3]。環境中的BPA及Cd可通過多種途徑復合污染食品，隨攝食共同進入人體，產生聯合毒性[4]，因此，BPA與Cd對女性生殖內分泌系統的聯合毒性具有很強的理論價值及現實意義，但到目前為止，尚未有關于此方面的報道。本研究采用亞慢性毒性實驗，對未成年雌性小鼠展開BAP與Cd雌性生殖內分泌聯合毒性研究，為改善生態環境及保護人群健康提供參考依據。

1 材料與方法(Materials and method)

1.1 實驗動物

3周齡雌性SPF級昆明小鼠40只，體重(10～14) g，由中國軍事醫學科學院動物中心提供，動物許可證號SCXK-(軍)2007-004。動物房溫度控制在(23±2)℃，相對濕度為(40～70)%，12h/12h明暗周期，自由飲水，攝食。

1.2 主要實驗試劑與儀器

BPA，純度≥95%,由天津大茂化學試劑廠；CdCl2·2.5H2O，天津阿法埃莎化學有限公司；E2，孕酮P放免試劑盒，(天津九鼎生物技術公司)；超氧化物歧化酶活性(SOD)，丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所), ERα兔單克隆抗體；羊抗兔SABC免疫組化試劑盒(天津明川生物公司)；考馬斯亮藍G250(sigma公司)；722型可見光分光光度計(上海第三分析儀器廠)；全自動γ放射免疫計數儀(海核所日環光電儀器有限公司)；1X51型倒置相差熒光顯微鏡及拍照系統(日本Olympus)。

1.3 動物分組與染毒

小鼠適應性喂養3 d后，按體重分層隨機分為四組：對照組、BPA組(1.5 mg·Kg-1)、Cd組(1.25 mg·Kg-1，Cd2+計)，BPA+Cd組(BPA1.5 mg·Kg-1+Cd2+1.25 mg·Kg-1)，采用灌胃方式進行染毒，每天一次，連續5周。以0.5% CMC-Na 為溶劑配置Cd溶液及BPA均勻混懸液，現用現配，對照組給予溶劑灌胃。

1.4 指標的檢測

1.4.1 性成熟過程觀察

觀察動情周期：染毒周期結束后，于每天早晚7:00采用陰道脫落細胞涂片法觀察并記錄小鼠動情周期變化，觀察期限為5 d[5]。由于陰道脫落細胞圖片判斷動情后期及動情間期區別不明顯，本次合并計算動情后期及動情間期時間。

1.4.2 體重及臟器系數

染毒結束后，于動情間期或動情后期稱重(處死體重)，乙醚麻醉，摳眼球取血，頸椎脫臼處死。取肝臟、卵巢及子宮，稱重，計算臟器系數。臟器系數=臟器重/處死體重。

1.4.3 卵巢激素水平的檢測

采用放射免疫方法測定血清中E2及P的含量，采用九鼎生物技術公司(天津)放免試劑盒，嚴格按照試劑盒操作規程操作。E2加標回收率為98%；P加標回收率96%。

1.4.4 卵巢抗氧化指標

SOD采用黃嘌呤氧化酶法，MDA采用硫代巴比妥酸反應物法(TBA)，卵巢組織蛋白含量采用考馬斯亮藍G250染色法。采用南京建成試劑盒，嚴格按照試劑盒步驟進行操作。

1.4.5 子宮組織ER表達

將子宮置于4%中性多聚甲醛固定液中，脫水，透明，石蠟包埋，行5m切片。60℃烤片2 h后按照免疫組化試劑盒規程進行染色，拍照，采用IMAGE-PRO PLUS5.0圖像分析軟件觀察子宮組織內膜下層細胞ERα表達情況，以細胞核/細胞漿內出現明顯棕黃色顆粒為ERα陽性表達。每張切片至少觀察5個視野，每個視野計算200個細胞。

ERα陽性表達率=ERα陽性細胞數/計細胞總數。

1.5 統計方法

2 結果(Results)

2.1 染毒一般情況觀察

染毒后期，各染毒組小鼠活動明顯減少，攝食減少，以聯合染毒組小鼠明顯。解剖發現各染毒組小鼠腹腔內有不同程度的非血性滲出液，未見臟器及卵巢有明顯病理學改變。

對小鼠的性成熟過程觀察發現，與對照組比較，Cd組及聯合組的動情周期時間顯著延長(P<0.05)；各組動情前期時間無差異(P>0.05)；各染毒組的動情期縮短，動情后期及間期時間延長(P<0.05)，見表1。

2.2 小鼠體重及臟器系數

與對照組比較，Cd組的處死體重及子宮系數顯著降低(P<0.05)，聯合組的處死體重、肝臟系數顯著降低(P<0.05)；聯合組的處死體重顯著低于BPA組及Cd組(P<0.05)；各組的卵巢系數無差異(P<0.05)，見表2。

2.3 小鼠血清卵巢激素水平及抗氧化水平

與對照組比較，BPA組的卵巢T-SOD、MDA水平、血清E2及P等指標無顯著性差異；Cd組血清E2水平降低；聯合組的卵巢T-SOD活力降低，卵巢MDA含量增高，血清E2水平降低(P<0.05)。各組血清孕酮水平無顯著性差異(P<0.05)，見表3

表1 BPA和Cd聯合染毒對幼年雌性小鼠性成熟過程影響±S, n=10)

注： 肩注不同字母表示P<0.05。

Note: Shoulder note by the different letters indicate P<0.05.

表2 BPA和Cd聯合染毒對幼年雌性小鼠體重及臟器系數影響±S, n=10)

注： 肩注不同字母表示P<0.05。

Note: Shoulder note by the different letters indicate P<0.05.

表3 卵巢抗氧化指標的影響

注： 肩注不同字母表示P<0.05。

Note: Shoulder note by the different letters indicate P< 0.05

2.4 小鼠子宮內膜下層雌激素受體表達

如圖1所示，與對照組比較，各染毒組的子宮內膜下細胞ERα表達降低。對照組、BPA組、Cd組子宮內膜下層細胞陽性表達率分別為(73.80±5.39)%，(65.00±7.75)%，(60.20±12.48)%，(36.00±11.70)%。經統計分析，Cd組及聯合組的ERα表達顯著低于對照組，聯合組的ERα表達顯著低于Cd組及BPA組(P<0.05)。

如圖2所示，ERα表達的陽性細胞顯示為褐色或棕黃色，而ERα陰性的細胞經免疫組化染色后顯為藍色。在子宮組織中，子宮上皮細胞、間質細胞和平滑肌肌細胞核內均有表達，對照組的ERα陽性表達細胞較多，BPA組及Cd組次之，而聯合組的ER表達最少，明顯弱于其它各組；未能發現各劑量組ERα在子宮組織中各類細胞的分布有顯著變化。

3 討論(Discussion)

BPA學名為2，2-雙(4-羥基苯基)丙烷，被廣泛的應用于塑料制品等工業產品生產中，可通過食品包裝材料直接或間接地污染食品。而Cd是人體接觸最多的重金屬，廣泛的分布在環境介質中，可由食品加工過程的污染進入到食品中。調查發現，中國受Cd污染的區域大部分處于工業發達地區，這些區域不可避免的同時受到BPA和Cd的污染[6]。因此，BPA和Cd可能通過食品介質對人體產生聯合毒性。

圖1 BPA和Cd聯合染毒對幼年雌性小鼠子宮內膜下層ERα表達率的影響注：a表示與對照組比較P<0.05；b表示與聯合組比較，P<0.05。Fig. 1 Effect on ER expression in endometrial of young female mice treated with BPA and Cd combined exposureNote: a means P<0.05 compared with control group;b means P<0.05 compared with combination group

圖2 雌性小鼠子宮內膜下層ERα表達免疫組化圖注：A 對照組；B BPA組；C Cd組；D BPA+Cd組(×400)Fig. 2 ER immunohistochemistry figure of endometrium in female miceNote: A Control group; B BPA group; C Cd group; D BPA+Cd group (×400)

但由于目前的認識水平和研究方法的限制，對于BPA和Cd聯合作用的了解尚不夠充分，本研究對BPA和Cd雌性生殖內分泌毒性聯合作用進行了初步研究，結果表明，BPA和Cd聯合染毒后，可破壞卵巢組織性激素分泌功能，能協同降低卵巢組織的抗氧化能力及抑制子宮組織中ERα的表達。

目前，化學物聯合毒性可分為協同、獨立、拮抗、允許等多種形式，但其作用機制尚不清楚，可能與生物轉化、受體作用、物質間的化學反應功能疊加或拮抗有關[7]。當兩種化學物作用于同一靶器官且有相同的毒性作用時，可通過多種機制對機體產生影響，從而產生聯合毒性。國內外研究表明， BPA和Cd都能作用于卵巢， 并產生某些相同的毒性作用，如BPA可以增加未成年大鼠閉鎖卵泡比例，抑制卵巢發育[8],改變血清中E2及P的水平[9]。而Cd能在卵巢蓄積，促進卵泡閉鎖[10]，促進卵泡顆粒細胞凋亡[11]，降低卵巢分泌雌、孕激素分泌[12]，但其作用機制尚不清楚。本研究發現，BPA與Cd聯合染毒并沒有對卵巢組織分泌E2及P功能產生協同作用，推測可能與BPA及Cd影響E2及P的作用機制不同有關，有待于進一步研究。此外，已有研究表明， Cd與BPA都能對包括卵巢在內的多個生殖組織器官產生氧化損傷[13-14]，本研究發現，在本次實驗劑量條件下，BPA及Cd單獨染毒未影響卵巢組織的抗氧化能力，但聯合染毒后顯著增加了小鼠卵巢組織氧化損傷，表現出協同效應。

激素器官對激素的反應不僅取決于機體激素濃度，也取決于激素靶器官中受體的含量，因此，兩種化學物還可通過受體的相互作用而產生聯合協同作用。子宮是雌激素的主要靶器官，其生理功能的調節依賴于雌激素和ER的相互作用，ER丟失可導致子宮組織細胞中的雌激素靶基因對雌激素的反應性，從而影響雌性機體的生殖功能。ER在哺乳動物子宮中有ERα和ERβ兩種亞型，其中ERα表達占優勢，在子宮生理功能的調節過程中發揮主導作用，而ERβ表達微弱，其生理功能尚不清楚。較多的國內外研究表明，BPA與Cd都能與雌性生殖組織中的ER相互作用，如可以模擬雌激素與ER結合，調節ER表達及影響內源性E2與ER的親和力[15-16]。本次實驗劑量條件下， Cd降低了子宮組織所有類型細胞，包括上皮細胞、間質細胞和平滑肌細胞中ERα表達， BPA對ERα表達無影響，而BPA與Cd聯合染毒后， ERα表達顯著低于單獨染毒組，說明BPA及Cd對子宮組織各類型細胞ERα表達的抑制作用具有協同效應，而對ER親和力的影響是否具有協同效應需進一步探索。

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Collective Effect of BPA and Cd at the Subchronically Level on Reproductive Endocrine in Immaturate Female Mice

He Qingfeng1,*, Li Hong2, Li Yanjie3, Zhang Pingping1, Zhang Ailin1, Wu Haiqing1

1. Food Science and Biotechnology Department in Tianjin Agriculture College, Tianjin 300384, China 2. Pharmacy Department in Fujian Health College, Fuzhou 350101, China 3. Computer and Information Engineering Department in Tianjin Agriculture College, Tianjin 300384, China

Received 23 May 2014 accepted 20 August 2014

There are a lot of research about endocrine disrupting toxicity of bisphenol A (BPA) or cadmium(Cd), but no studies have been carried out to shed light on combined toxicity of BPA and Cd. Forty Kunming female juvenile mice were randomly divided into 4 groups(normal control，BPA，Cd，and BPA plus Cd group). The mice were treated by gavage for 5 successive weeks. By the end of the experiment, the estrus cycle, antioxidant activity of ovary, serum sex hormone levels and estrogen receptor-alpha(ERα) expression in endometrium of mice were detected. Compared with control group，there are difference on time of estrus, body weight, uterus coefficient, serum E2 levels and endometrium ERαexpression in treated groups; Ovary T-SOD activity and MDA levels were no signifficantly different in BAP group and Cd group compared to the control group (P>0.05), however, ovary T-SOD activity and MDA levels in collective group were significantly different compared with those of the control group (P<0.05). Furthermore, endometrium ERαexpression (36±11.7)% in collective group were lower than those of single-dose groups (P<0.05). Combined effect of BPA and Cd is more toxic than that of single dose exposure, impact on ERαexpression and oxidative damage may be the mechanisms of the combined toxicological effect．

bisphenol A; cadmium; combined effect; female; reproductive endocrinology

天津農學院教學改革項目(12-A2-03)

何慶峰(1979-)，男，講師，碩士，食品毒理方向，E-mail: hqf42109510@163.com

10.7524/AJE.1673-5897-20140523002

2014-05-23 錄用日期：2014-08-20

1673-5897(2015)3-129-06

X171.5

A

何慶峰，李宏，李燕杰, 等. 雙酚A聯合鎘亞慢性染毒對未成年雌性小鼠生殖內分泌干擾作用[J]. 生態毒理學報，2015, 10(3): 129-134

He Q F, Li H, Li Y J, et al. Collective effect of BPA and Cd at the subchronically level on reproductive endocrine in immaturate female mice [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 129-134 (in Chinese)