銅銹環棱螺室內實驗條件優化

范強，陶秉春，王博，張責研，曾瑞，安立會,*

1. 天津農學院，天津 300384 2. 中國環境科學研究院，北京 100012

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銅銹環棱螺室內實驗條件優化

范強1,2，陶秉春1，王博2，張責研2，曾瑞2，安立會2,*

1. 天津農學院，天津 300384 2. 中國環境科學研究院，北京 100012

銅銹環棱螺作為一種新興的潛在生態毒理學模式生物，適宜實驗條件是開展其室內毒理學研究的基礎。在人為控制條件下，初步探討了餌料、水深、底質、密度和鈣離子濃度養殖條件對銅銹環棱螺成體生長的影響，并進一步對麻醉條件進行了篩選(MgCl2·2H2O、乙醇、丁香酚、鹽酸普魯卡因和MS-222)。結果表明：當投喂冰鮮小球藻、密度6 個·L-1水體積、水深10～15 cm、泥土底質并且水中鈣離子濃度30 mg·L-1時，銅銹環棱螺的體重增長最為明顯。麻醉效果表明，MgCl2·2H2O對成螺的麻醉時間短并且傷害小，可作為實驗用麻醉劑首選。以上研究結果為發展以銅銹環棱螺為模式生物開展環境(生態)毒理學研究奠定了基礎。

銅銹環棱螺；模式生物；養殖條件；麻醉劑；優化

當前，隨著環境(生態)毒理學的快速發展和科學需求，無脊椎軟體動物作為一種新興模式生物得到了前所未有的關注，并在水質安全、沉積物質量以及危險化學品毒性評估等研究中得到了應用[1-2]。研究發現，軟體動物對污染物暴露表現出比脊椎動物(如魚類)更為敏感的特征，如淡水泥螺(Potamopyrgus antipodarum)比虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、鯉魚(Cyprinus carpio)和黑頭呆魚(Pimaphales promelas)等脊椎動物對內分泌干擾物(如雌激素)以及污水處理廠出水產生更為明顯的內分泌干擾效應[3]，而河蚌(fatmucket, Lampsilis siliquoidea)對水環境中銅和氨氮表現出比現有標準生物更高的靈敏度[4]，促使美國EPA對淡水水質指標中的氨氮標準做了修訂[5]。

銅銹環棱螺(Bellamya aeruginosa)，屬軟體動物門(mollusca)、腹足綱(gastropoda)、田螺科(viviparidae)，廣泛分布于我國的河流和湖泊中，在水生態系統食物網的物質循環和能量流動中發揮著極其重要的作用[6]。同時，銅銹環棱螺為雌雄異體，卵胎生，易于飼養、個體規格適中、生長快、繁殖能力強，可作為一種潛在的淡水無脊椎模式生物開展生態毒理學研究[7]。近年，國內以銅銹環棱螺作為實驗生物開展的毒理學研究逐漸增多[8-12]，這就要求能夠連續供應高質量的實驗生物，從而也對生物的室內養殖條件提出了較高要求。然而，與斑馬魚和爪蟾等其它模式生物已有的室內養殖規范和條件相比[13-14]，目前銅銹環棱螺室內養殖并沒有成熟的養殖體系，不同實驗室根據自身條件來養殖所需的實驗生物，這就造成不同實驗室之間所取得的科學數據不具有可比性，從而嚴重限制了以銅銹環棱螺作為模式生物的科學發展。

本文以體重增長率為評判終點，分別從餌料、水深、底質、密度和鈣離子角度方面對銅銹環棱螺的室內養殖條件進行了優化，并對不同麻醉劑的麻醉效果進行了比較，研究結果為以銅銹環棱螺為模式生物開展生態毒理學研究奠定了基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗用銅銹環棱螺(體重：1.72±0.48 g；殼高：29.4±2.4 mm)采于全國水產引育種中心(北京)池塘。將捕撈的實驗螺置于實驗室內暫養3～5 d(24±0.5 ℃)，根據觸角的第二性特征區分雌雄(雌螺：左右兩只觸角等長并且直；雄螺：左側觸角彎曲并特化成雄性交接器(腹面觀))，每天投喂新鮮微綠球藻并更換部分充分曝氣的自來水，同時連續充氣以保證溶解氧水平。

1.2 室內養殖因子優化

隨機挑選活力強的實驗螺放入實驗缸，每組設置3個平行。實驗缸為一次成型玻璃缸(30×20×30 cm)，實驗用水為活性炭過濾并充分曝氣的自來水(鈣離子優化實驗用水為去離子水)。在實驗前24 h注水備用，同時每個缸進行連續充氣以保證溶解氧水平。所有養殖因子優化條件均為水溫24±0.5 ℃，光周期為8(白):16(暗)。

實驗前和實驗2周后稱量每只螺體重，計算體重增長率。另外，在實驗結束后解剖實驗螺，計數子宮內胚胎數量(分為有殼胚胎和無殼胚胎)。

1.2.1 餌料

將挑選的實驗螺隨機分組(10 只·組-1)，并分別以魚薄片餌料(粗蛋白：>40%；粗脂肪：>2.5%：粗纖維：(2～5)%；鈣：(0.9～2.0)%；磷：(0.8～1.4)%)(北京三元飼料)、淡水小球藻(C. vulgaris)(大連海洋大學水生生物實驗室提供)、雞蛋黃、玉米面和萵苣葉(市場購買)為實驗餌料，投喂量均為0.5 g·次-1，每天2次。實驗期間，每天換水1次，每次半量換水。其它條件同上。

1.2.2 水深

將挑選的實驗螺隨機分組(10 只·組-1)，分別設置水深為5 cm、10 cm、15 cm和20 cm。每天投喂新鮮小球藻2次(0.5 g·次-1)，并換水1次，每次半量換水。其它條件同上。

1.2.3 底質

將挑選的實驗螺隨機分組(10 只·組-1)，分別以細沙、細土、碎石塊、玻璃(缸)作為底質進行比選。其中，細沙和細土使用前用前需過篩去除較大顆粒和其它雜質，并徹底風干后使用；碎石在高錳酸鉀溶液(0.1%)浸泡24 h并充分清洗后使用。鋪設時基質厚5 cm，上面覆水10 cm。實驗期間，每天投喂新鮮小球藻2次(0.5 g·次-1)，每周換水1次，并更換基質1次。其它條件同上。

1.2.4 密度

將挑選的實驗螺以10 個·組-1、20 個·組-1、30 個·組-1、40 個·組-1和60 個·組-1進行隨機分組。每天投喂新鮮小球藻2次，分別為0.5 g·次-1、1.0 g·次-1、1.5 g·次-1、2.0 g·次-1、3.0 g·次-1。實驗期間每天換水1次，每次半量換水。其它條件同上。

1.2.5 鈣離子(Ca2+)

將挑選的實驗螺隨機分組(10 只·組-1)，實驗用水用去離子水配置：123.3 mg·L-1MgSO4·7H2O, 63.0 mg·L-1NaHCO3, 5.5 mg·L-1KCl。鈣離子濃度(CaCl2·2H2O)分別為0，10，30，100，300，500 mg·L-1。實驗期間每天換水1次，每次半量換水。其它條件同上。

1.3 麻醉劑效果比較

麻醉是開展生物毒理學的必要手段，良好的麻醉效果是取得滿意結果的基本前提。因此，本文以5種常見麻醉劑為研究對象，初步篩選和比較了不同麻醉劑的麻醉效果,以期為今后開展相關研究奠定基礎。具體來講，實驗以MgCl2·2H2O(MgCl2)、丁香酚、酒精、鹽酸普魯卡因、間氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸鹽(MS-222)5種麻醉劑作為篩選藥品，其中MgCl2濃度設定為0、0.5、1、5、10和20 g·L-1，MS-222為0、5、10、30、100和300 mg·L-1，95%酒精濃度為0、0.5、1、3、5和10%(體積比)，丁香酚濃度為0、0.5、1、3、5、10 mg·L-1；鹽酸普魯卡因濃度為0、5、10、30、100和300 mg·L-1。

將挑選的實驗螺隨機分組(10 只·組-1)放入結晶皿中(?=18 cm)，加入1 L經活性炭過濾并充分曝氣的自來水(24±0.5)℃，利用蠕動泵滴加麻醉劑至設置的終濃度(約2 h)，期間每隔10 min觀察1次。觀察時，用針頭輕輕刺激螺的腹足，若沒有反應或反應不靈敏，則判定螺處于麻醉狀態，記錄麻醉所需時間。2.5 h后，將處于麻醉狀態的螺移至清水中繼續觀察，每30 min觀察1次，觀察方法同上，記錄恢復螺數目與恢復時間。根據預實驗結果，6.5 h后若有螺仍處于麻醉狀態(刺激沒有反應)，則認為螺死亡。

1.4 數據分析

各組所得數據以平均值±標準偏差(Mean±S.D)表示。對所得各組數據利用Origin 9.0軟件包的進行單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗各養殖條件的差異性，當P<0.05時用Turkey進行多重比較以檢驗實驗組間的差異性。對各組麻醉率采用非參數檢驗麻醉效果之間的差異性(SPSS 13.0)。

2 結果與討論(Results and Discussion)

2.1 餌料優化

從圖1可以看出，投喂魚餌料組實驗螺體重增長率為(7.20±2.08)%，而其它各組的增長率相近(1.92%～2.89 %)，各組之間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 餌料對螺體重增長的影響Fig. 1 Bellamya aeruginosa body growth feeding with different foods

需要指出的是，魚餌料與小球藻投喂組實驗螺體重增長率的標準偏差較小，而萵苣葉、雞蛋黃與玉米面組的偏差較大，說明魚餌料和小球藻投喂的效果最好，可作為室內養殖螺的首選餌料，尤其是魚餌料是人工配合餌料，含有生物生長發育所需的各種營養元素包括粗蛋白、粗脂肪以及鈣和磷等元素。Eveland等[15]也發現投喂混合餌料的螺個體和繁殖能力均得到提高。然而，人工配合餌料中可能會含有一些促生長劑和增色劑等添加物，這對一些特定實驗目的研究如揭示化學品的內分泌干擾效應就可能產生干擾，而小球藻作為天然產物(浮游植物)可作為首選餌料。

另外，從繁殖力(胚胎數量)來看，投喂不同餌料之間沒有顯著性差異(P>0.05)。然而，投喂小球藻和萵苣葉的實驗螺懷有的胚胎中，有殼胚胎數量多于無殼胚胎，而投喂其它餌料(魚餌料、雞蛋黃和玉米面)實驗螺懷有的無殼胚胎多于有殼胚胎，說明投喂小球藻和萵苣葉的植物性餌料有利于螺的胚胎發育。綜合來看，室內養殖銅銹環棱螺的餌料應以小球藻為最適餌料，期間可適當輔以魚餌料進行混合投喂。

2.2 水深優化

由圖2可以看出，以15 cm水深組實驗螺的體重增長率最大，其次為10 cm水深組，而5 cm水深組的增長率最低，但不同水深組實驗螺體重增長率之間沒有明顯差異(P>0.05)，說明在室內條件下，水深對實驗螺體重增長并不是一個主要因子。另外，從各組體重增長率的標準偏差來看，5 cm和20 cm水深組實驗螺個體間的差異較大，暗示養殖水過深或過淺可能均不利于螺生長。考慮到螺生長的水環境質量和空間需要，室內養殖的水深最好控制在10 ～ 15 cm為好。

2.3 底質優化

由圖3可以看出，細土底質組實驗螺體重增長率最高，并且顯著高于玻璃底質(P<0.05，Turkeytest)，但與細沙和碎石塊組之間沒有顯著性差異(P>0.05)，這可能是由于土質中含有大量有機質而促進螺的生長。在自然環境中，螺可以棲息在泥質中，并經常吸附在石塊、木質等固體附著物上，而沙質則不利于螺的生長，這與實驗室結果相近。然而，在實驗室條件下，長時間的泥質容易變質而不利于螺生長，這就需要定期更換泥質以保持適于螺的生長環境。當然，由于螺的棲息環境不同，因此對底質的要求也就不同，本文銅銹環棱螺以泥土底質生長最好，而Bulinus nyassanus則在沙底質的環境生長最好[16]，這可能與不同螺在自然界中所處的自然棲息環境有關。因此，底質的選擇要根據目標生物在自然環境中的棲息環境并結合室內優化結果做出合適的選擇。

2.4 密度優化

從圖4可以看出，隨著養殖密度增大，實驗螺體重增長率呈先增加(從2 個·L-1到6個·L-1)、后降低(從6 個·L-1到12 個·L-1)趨勢，并且6 個·L-1組實驗螺體重增長率顯著高于其它各組(P<0.05)。這個密度明顯高于Biomphalaria glabrata室內養殖的密度要求(2 ～ 50 個·L-1)[17]。對于前期隨密度增大體重增長率增加，可能是由于個體間存在著一定的協同效應，從而相互促進增長；而后期隨著密度增大體重增長率降低，可能是由于密度增加導致單位空間個體間競爭，從而導致體重增加減慢。并且，如果是靜水養殖，隨著單位密度增大，可能會導致水環境溶解氧水平降低，如高密度螺在靜水中養殖4 d后，水體中溶解氧水平明顯低于正常養殖密度水體內的溶解氧水平[18]。以上結果說明，螺的室內養殖會存在密度因子限制，這對開展室內相對小空間范圍內的養殖系統提出了要求。

圖2 水深對螺體重增長的影響Fig. 2 Bellamya aeruginosa body growth at different water depths

圖3 底質對螺體重增長的影響Fig. 3 Bellamya aeruginosa body growth at different sediments

圖4 密度對螺體重增長的影響Fig. 4 Bellamya aeruginosa body growth at different densities

2.5 Ca2+優化

從圖5可以看出，螺體重增長率隨著鈣離子濃度增加呈先增加(0到30 mg·L-1)、后降低(30到500 mg·L-1)的趨勢，并在30 mg·L-1時體重增長率達到最高。另外，10, 30, 100 mg·L-1組與0 mg·L-1組螺體重增長率均具有顯著性差異(P<0.05)，說明鈣離子對螺生長發育具有重要作用。如當環境中鈣離子水平低于2 mg·L-1時，螺個體就會明顯減小并且螺殼容易產生畸形[19]。當水環境中鈣離子濃度高于300 mg·L-1甚至達到500 mg·L-1時，螺體重增長率反而降低，并且明顯低于30 mg·L-1組(P<0.05)，說明鈣離子濃度過高時可能會對螺產生毒害作用，從而抑制了體重的增長，這與Mishkin and Jokinen結果一致[15]。以上結果說明，水體中鈣離子濃度處于30 mg·L-1時最為適合螺的生長發育，這與Biomphalaria glabrata (say)對環境鈣水平的要求相似[15]。這明顯低于我國生活飲用水中硬度標準(硬度(CaCO3)：450 mg·L-1；折合鈣離子：180 mg·L-1)(GB 5749-2006)，這就要求在螺的室內養殖中，需要對鈣離子進行適當控制。

2.6 麻醉劑優化

麻醉劑對螺的麻醉效果見圖6。從麻醉時間來看，在30 min后MgCl2各組均產生一定的麻醉效果，其中10 和20 g·L-1組的麻醉率超過了50%，并且顯著高于0.5 g·L-1組(P<0.05)，在150 min后達到了80%，而20 g·L-1組則為100%(圖6-(a))。而從恢復效果來看，只有低濃度(0.5, 1 和5 g·L-1)組能夠全部恢復活力(4.5～6.5 h)，而高濃度組(10和20 g·L-1)的恢復率分別只有66.67%和40%(6.5 h)。對于其它麻醉劑(圖6-(b)、(c)、(d)和(e))，只有10%乙醇濃度組和300 mg·L-1的鹽酸普魯卡因在30 min時產生了較弱的麻醉作用(10%～20%)，其它各組的麻醉率直到90 min后超過50%。從恢復效果來看，乙醇組的恢復效果最好，低濃度組(0.5%，1%和3%)在6.5 h后恢復率均到達了100%，高濃度組(5%和10 %)的恢復率也超過了50%。另外，高濃度乙醇(5%和10%)的麻醉率顯著高于低濃度(0.5%)(P<0.05)，同樣，高濃度丁香酚(10 mg·L-1)的麻醉率也顯著高于低濃度(0.5 mg·L-1)的麻醉率(P<0.05)。而丁香酚、鹽酸普魯卡因和MS-222在6.5 h后只有最低濃度組的恢復率達到了100%，其它各組只有50%左右甚至更低，并且各處理組之間的麻醉率的差異不顯著(P>0.05)。綜上所述，MgCl2(5～10 g·L-1)對螺的麻醉效果最好，其次為乙醇，其余3種則沒有明顯區別。

綜上所述，在室內養殖模式下，以泥土底質、密度為6 個·L-1、水深10～15 cm、水體鈣離子濃度為30 mg·L-1，并投喂小球藻可作為銅銹環棱螺的適宜養殖條件；在生物麻醉處理時，MgCl2可作為實驗處理的首選藥劑。

圖5 鈣離子對體重增長的影響Fig. 5 Bellamya aeruginosa body growth at different calcium ion levels

圖6 麻醉劑對螺的麻醉效果Fig. 6 Effects of different anesthetics for Bellamya aeruginosa

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A Study of the Laboratory Conditions ofBellamyaaeruginosa

Qiang Fan1,2, Bingchun Tao1, Bo Wang2, Zeyan Zhang2, Rui Zeng2, An Lihui2,*

1. Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China 2. State Environmental Protection Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China

Received 17 October 2014 accepted 29 November 2014

Bellamya aeruginosa could be used as a potential ecotoxicological model organism; however, the first requirement for future research is to optimize laboratory conditions. The present study optimized food, water depth, bottom materials, density, and calcium ion concentration for Bellamya aeruginosa cultured under artificial conditions using weight gain ratio as the endpoint, and then followed by evaluation of different anesthetics including MgCl2·2H2O, ethanol, eugenol, procaine hydrochloride and MS-222. Results indicated that growth was optimal with the following conditions: feeding fresh C. vulgaris, culturing at a density of 6 number·L-1, keeping the water depth at 10 ～ 15 cm, using fine soil as the bottom material and keeping the calcium ion concentration at 30 mg·L-1. Furthermore, results showed that MgCl2·2H2O should be the primary choice of anesthetic for this organism. These conditions will result in proper rearing and maintenance of Bellamya aeruginosa for use as a model organism in future.

Bellamya aeruginosa; model organism; culture condition; anesthetic; optimization

國家水體污染控制與治理科技重大專項(2013ZX07501005)；國家自然科學基金項目(21177117)

范強(1990-)，男，碩士研究生，研究方向為水生毒理學，E-mail: s0804014121@126.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: anlhui@163.com

10.7524/AJE.1673-5897-20141017002

2014-10-17 錄用日期：2014-11-29

1673-5897(2015)3-200-09

X171.5

A

安立會(1975-)，男，環境科學博士，副研究員，主要研究方向為生態毒理學，發表學術論文30余篇。

范強，陶秉春，王博, 等. 銅銹環棱螺室內實驗條件優化[J]. 生態毒理學報, 2015, 10(3): 200-208

Fan Q, Tao B C, Wang B, et al. A study of the laboratory conditions of Bellamya aeruginosa [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 200-208 (in Chinese)