碲化鎘量子點Cd2+釋放對小鼠肝、腎組織毒作用的研究

王萌萌，王吉龍，孫湖泊，孫志偉，黃沛力,*

1.首都醫科大學公共衛生學院，北京 100069 2.環境毒理學北京市重點實驗室，北京 100069 3.北京體育大學醫院，北京 100084

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碲化鎘量子點Cd2+釋放對小鼠肝、腎組織毒作用的研究

王萌萌1, 2，王吉龍1, 2，孫湖泊1, 3，孫志偉1, 2，黃沛力1, 2,*

1.首都醫科大學公共衛生學院，北京 100069 2.環境毒理學北京市重點實驗室，北京 100069 3.北京體育大學醫院，北京 100084

探討碲化鎘量子點(cadmium telluride quantum dots,CdTe QDs) Cd2+釋放與其體內毒性之間的關系。將24只雄性ICR小鼠(24.7～26.8g)隨機分為4組，每組6只，分別為0 nmol組(對照組)、5 nmol染毒組、50 nmol染毒組和500 nmol染毒組(以Cd2+的摩爾濃度計算)。采用尾靜脈注射方式進行染毒，染毒組注射0.15 ml不同濃度的CdTe QDs溶液，對照組注射同等體積的生理鹽水。染毒24h后小鼠脫臼處死，計算臟器系數，進行血常規和血清生化指標分析以及肝、腎組織的病理組織學檢查。選取金屬硫蛋白(metallothionein，MT)作為生物體內游離Cd2+水平的生物標志物，通過酶聯免疫吸附實驗(ELISA)和免疫組織化學技術檢測小鼠肝、腎組織中的MT水平。結果表明，各染毒組小鼠肝、腎臟器系數與對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)，尿素氮水平與對照組相比顯著降低(P<0.01)。隨著染毒劑量增加，小鼠肝、腎組織病理改變逐漸加重，肝細胞可見不同程度的水性樣變和腫脹；腎小管管腔水腫、腎上皮細胞水樣變性，以及遠曲小管水腫。染毒組小鼠肝、腎組織中MT的含量與對照組相比明顯升高(P<0.05)，且隨著染毒劑量增加MT表達增強。研究結果提示，CdTeQDs對小鼠肝、腎組織具有一定的毒作用，其毒作用大小與CdTeQDs降解釋放的游離Cd2+含量呈正相關。

碲化鎘量子點；Cd2+；金屬硫蛋白；毒性；ICR小鼠

量子點(quantum dots，QDs)，又稱為半導體納米晶體，是一種由II～VI族或III～V族元素組成的納米顆粒。近年來，QDs因其具有獨特的熒光特性作為1種新型的熒光探針被廣泛應用于細胞成像、追蹤和標記等一些生物學方面的研究[1]。鎘(cadmium，Cd)元素，是鎘系QDs的主要成分，由于重金屬元素Cd易于聚集在肝臟和腎臟組織中，并對機體和組織造成損傷[2]，因此對QDs潛在毒性的研究成為當今亟待解決的熱點問題。目前，國內外關于QDs對細胞毒性效應的研究報道很多，其毒性機制研究主要集中在游離Cd2+的釋放、氧化過程中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生以及活性氧自由基介導的氧化應激(oxidative stress，OS)等方面的探討。Chen等[3]認為QDs的毒性與氧化過程中Cd2+的釋放直接相關；Tang等[4-6]則認為ROS是導致QDs毒性產生的原因；Cho等[7]通過體外實驗證明了QDs毒性的產生是Cd2+和ROS共同作用的結果。與QDs的細胞毒性研究不同，QDs對生物體毒性作用的報道眾說紛紜。Wei Liu等[8]研究發現小鼠在暴露QDs 2 d和6周后均可以引起肝臟毒性。蘇媛媛等[9]的研究則認為低劑量的QDs長期暴露對組織沒有毒性作用。Ken-Tye Yong等[10]觀察恒河猴在染毒QDs 3個月內的臨床表現，沒有發現異常情況。為了進一步探討QDs的體內毒性作用及其影響因素，本研究選取雄性ICR小鼠，尾靜脈分別注射不同劑量的CdTe QDs溶液，通過分析小鼠血常規和血清生化指標及肝、腎組織的病理組織學改變，探討QDs的毒性作用。選取金屬硫蛋白(metallothionein，MT)作為生物體內游離Cd2+水平的生物標志物，通過酶聯免疫吸附實驗(ELISA)和免疫組織化學技術檢測小鼠肝、腎組織中的MT水平，探討CdTe QDs降解所釋放的游離Cd2+含量對小鼠肝、腎組織毒作用的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗動物與試劑

雄性ICR小鼠，體重24.7～26.8 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司；CdTe QDs購于南京捷納思新有限公司(激發波長490 nm，發射波長620 nm)；蘇木精、伊紅(純度99.9%，美國Sigma公司)；小鼠MT酶聯免疫檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；其它試劑均為分析純，購于中國國藥有限公司。

1.2 儀器設備

臺式高速離心機(德國Eppendorf公司)，RF-5301pc熒光分光光度儀(日本Shimadzu公司)，JEM-1400透射電子顯微鏡(日本Jeol公司)，Mili-Q超純水機(法國Milipore公司)，MEK-6318K 血液分析儀(日本Nihon Kohden公司)；BX50型倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 動物實驗

24只雄性ICR小鼠(24.7～26.8 g)隨機分為4組，每組6只，分別為0 nmol組(對照組)、5 nmol染毒組、50 nmol染毒組和500 nmol染毒組(以Cd2+的摩爾濃度計算)。采用尾靜脈注射方式進行染毒，染毒組注射0.15 mL不同濃度的CdTe QDs溶液，對照組注射同等體積的生理鹽水。24 h后頸椎脫臼處死小鼠，迅速將小鼠置于冰盤上，取出肝臟、腎臟并稱重，一部分用10%甲醛固定。所有小鼠在實驗前和處死前均進行稱重并記錄，所有組織用生理鹽水清洗后置于-80℃冰箱以備用。

1.4 血常規和血清生化的測定

1.5 肝、腎組織病理分析

將固定的肝、腎組織常規脫水，石蠟浸透、包埋、制備4 μm厚的石蠟切片，經蘇木精-伊紅染色(H&E染色)后，在顯微鏡下觀察病理組織變化。

1.6 MT免疫組織化學分析及含量測定

將固定的肝、腎組織常規脫水，石蠟包埋，切片，抗體用生物素法進行免疫組化染色，顯微鏡下觀察實驗結果。采用ELISA測定MT的含量。

1.7 統計學分析

除特別說明外，結果均采用SPSS 16.0軟件對各染毒組與對照組之間進行單因素方差分析，所有實驗數據采用平均數±標準差(Mean±SD)表示，顯著性檢驗采用T-檢驗來完成。P<0.05表示差異具有統計學意義，P<0.01表示差異具有顯著統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 CdTe QDs的表征

（3）論文請用A4紙打印，并請提供電子版（發送電子郵件,郵件名稱請標注“2019年第二屆微生物制劑在釀酒生產中的應用技術論文”投稿）；

CdTe QDs的透射電鏡結果見圖1，結果表明，電鏡下的CdTe QDs顆粒分散均勻，粒徑大約為3～4 nm。

2.2 血常規和血清生化指標

實驗組小鼠的精神狀態良好，飲水量、進食量未見明顯的異常表現。各實驗組肝、腎臟器系數與對照組比較，差異均無統計學意義(P >0.05)(表1)。在各項血液學指標中，除尿素氮以外，其它指標均呈現隨著染毒劑量的增加而緩慢增加的趨勢，但是沒有明顯的劑量效應關系，其中淋巴細胞和中性粒細胞在500 nmol染毒組分別為5.05±2.33，1.50±0.42，與對照組相比呈現升高趨勢(P <0.05)。實驗組的尿素氮水平與對照組相比均顯著降低(P <0.01)(表2)。

圖1 透射電鏡下，CdTe QDs的分布(標尺=20 nm)Fig. 1 TEM image of CdTe QDs(bars=20 nm)

表1 CdTe QDs對小鼠肝、腎臟器系數的影響(Mean± SD，n=6)

表2 CdTe QDs對小鼠血常規和血清生化指標的影響(Mean±SD，n=6)

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note: compare to controlgroup，*P<0.05，**P<0.01.

圖2 CdTe QDs對小鼠肝、腎病理組織學檢查結果(H&E染色，400)Fig. 2 Pathological changes of liver and kidneys were measuredfor mice treated with CdTe QDs(H&E, ×400)

2.3 組織病理學改變

如圖2所示，小鼠染毒24 h后，隨著染毒劑量的增加，肝臟和腎臟的病理學改變出現隨著劑量增加而加重的現象。與對照組相比，5 nmol染毒組小鼠肝臟的中央靜脈周圍比較正常，但肝小葉周邊有明顯的水樣變性，呈現從肝小葉周邊到中央的變化趨勢；50 nmol染毒組的肝臟出現彌漫性水樣變性并出現氣球樣變，變性比較明顯；500 nmol染毒組的水樣變更加嚴重，氣球樣變增多，肝細胞板出現溶解。對于腎臟組織，5 nmol染毒組的腎血管充血，腎小管管腔因水腫變得狹窄；50 nmol染毒組的腎小管上皮細胞水樣變性，核上包漿脫落，病變較5 nmol染毒組嚴重；500 nmol染毒組表現出染色偏淡，說明水腫更加嚴重(大白腎)，遠曲小管都出現水腫，包漿透亮并且疏松缺失，細胞出現腫脹擁擠。

2.4 免疫組織化學分析

肝、腎組織MT的免疫組織化學結果表明，隨著染毒劑量的增加，肝、腎組織中MT陽性細胞(棕色斑點)增多，染色加深(圖3)。與對照組相比，MT含量隨著染毒劑量的增加表現上升的趨勢，差異有統計學意義(P<0.05)(圖4)。

圖3 CdTe QDs對小鼠肝、腎組織MT的免疫組織化學結果((400，標尺=50 μm)Fig. 3 Immunohistochemistry with specific antibody against MT in liver and kidneysfor mice treated with CdTe QDs(×400, bars=50 μ m)

圖4 小鼠肝、腎組織中MT的含量結果(Mean±SD, n=6)，與對照組相比，*P<0.05Fig. 4 MTconcentrationdetermined by an ELISA in liver and kidneys for mice treated with CdTe QDs(Mean±SD), All data are represented as the mean±SD, n=6,compare to control group,*P<0.05

3 討論(Discussion)

研究發現，QDs極易進入到肝臟、腎臟、脾臟等網狀內皮細胞吞噬系統[11]。本課題組前期的實驗也表明，小鼠經尾靜脈染毒QDs后，QDs主要蓄積在肝臟和腎臟[12-13]，由于肝臟和腎臟是生物體重要的代謝與排泄器官，因此本研究從肝臟和腎臟入手對QDs的毒性作用進行了研究。

染毒組小鼠的血生化指標檢測結果表明：白細胞、淋巴細胞和中性粒細胞隨著染毒劑量的增加呈現上升趨勢，其中500 nmol染毒組的淋巴細胞和中性粒細胞與對照組相比升高，差異具有統計學意義。谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶升高，尿素氮水平顯著降低(P<0.01)，提示生物體內可能存在急性感染、炎性，肝細胞損傷，腎臟組織受損、代謝功能障礙，尿酸生成不足和轉化異常[14]等病理現象。

病理組織學檢查發現，小鼠經CdTe QDs染毒后的肝組織有不同程度的細胞腫脹、彌漫性水樣變性，腎組織可見腎小管管腔狹窄，充血等病變。肝、腎組織的病變程度隨著染毒劑量的增加而加重，呈現較為明顯的劑量-反應關系，進一步證實了CdTe QDs對小鼠肝、腎組織的毒性作用。

QDs的體外實驗研究表明，光照或氧化劑可以使QDs發生降解釋放Cd2+，導致QDs發射光譜藍移和熒光強度減弱[15]。Derfus等[16]采用MTT法研究CdSeQDs對細胞的毒性時發現，使用紫外光照射含有CdSeQDs的細胞培養液，可以使細胞的成活率明顯降低，提示CdSeQDs的毒性效應可能與CdSeQDs降解釋放出的Cd2+有關。楊炳君[17]等在評價CdTe QDs對小鼠肝細胞及腎小管上皮細胞成活率的影響時發現，CdTe QDs在細胞內可以釋放Cd2+，隨著CdTeQDs暴露濃度的增加，含Cd2+的細胞比例逐漸上升，細胞成活率逐漸下降。在體內實驗中，Fitzpatrick[18]等研究發現，CdSe/ZnS-mPEG 5000以存在于小鼠的循環系統和多個器官中，盡管個別器官中的QDs熒光信號可以維持很長時間，熒光波長卻發生了明顯的藍移，進一步提示QDs在體內發生了降解。由于QDs降解可以導致游離Cd2+產生，本研究進一步探討了游離Cd2+含量與QDs體內毒性的關系。理論上，游離Cd2+含量與QDs熒光波長藍移和熒光強度減弱有關，然而由于生物組織的復雜性和其背景光度值的不確定性，很難通過熒光分析法對QDs進行定性和定量分析[19]。電感耦合等離子體/質譜(ICP-MS)儀檢測金屬離子雖然具有極高的靈敏度，但只能測定體系中Cd的總量而不能區分游離態的Cd2+和結合態的Cd2+。MT是一種廣泛存在于大多數哺乳動物內臟器官(尤以肝、腎細胞為主)，具有抗氧化功能的蛋白[20]，Cd2+可以誘導細胞內MT的表達。Chia-Hua Lin等[21]以QD705(CdSe/Te-ZnS)和CdCl2分別代表結合態的Cd2+和游離態的Cd2+，處理腎腺癌細胞，結果發現，只有CdCl2處理的細胞中MT高表達，進一步證明了游離的Cd2+才能誘導MT表達，即MT可以作為QDs體內降解釋放Cd2+的生物標志物。本實驗通過ELISA和免疫組織化學法檢測了小鼠肝、腎組織中MT的表達水平。結果顯示，染毒組肝、腎組織中MT的含量隨著染毒劑量的增加而增加(P<0.05)，MT主要在肝細胞質和腎小管上皮細胞和近曲小管中出現了高表達，陽性細胞數隨著染毒劑量增加明顯增多。結合肝、腎組織的病理變化，本研究提示：CdTe QDs對小鼠肝、腎組織具有一定的毒作用，其毒作用大小與CdTe QDs降解釋放的游離Cd2+含量呈正相關。

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Hepatotoxicity and Nephrotoxicity of Cadmium Released from Cadmium Telluride Quantum Dots in Mice

Wang Mengmeng1, 2, Wang Jilong1, 2, Sun Hubo1, 3, Sun Zhiwei1, 2, Huang Peili1, 2, *

1. Capital Medical University School of Public Health, Beijing 100069, China 2. Beijing Key Laboratory of Environmental Toxicology, Beijing 100069, China 3. Hospital of Beijing Sport University, Beijing 100084, China

Received 19 December 2014 accepted accepted 26 January 2015

Hepatotoxicity and nephrotoxicity of cadmium ion (Cd2+) released from cadmium telluride quantum dots (CdTe QDs) in mice were investigated. A total of 24 ICR male mice (24.7～26.8 g) were randomly divided into four groups, and exposed to different concentrations (0, 5, 50, 500 nmol) of CdTe QDs via tail vein injection. The control group was injected with normal saline. After 24 h of the treatment, the organ coefficient and pathological changes of livers and kidneys, the serum biochemical indexes, hematologic indexes were measured. Metallothionein (MT) was selected as a biomarker of Cd2+exposure and determined by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and immunohistochemistry. The results showed that the blood urea nitrogen levels in serum of mice were all decreased (P<0.01) without obvious changes of the organ coefficient (P>0.05). Pathologic examination demonstrated hydropic degeneration of hepatocyte around the central vein, hepatocyte disorder, distal tubular expansion in liver and renal tubular muddy swollen, renal artery expansion hyperemia in kidneys. Compared with the control group, CdTe QDs exposed groups significantly induced the MT expression (P<0.05). Since the MT levels increased along with the exposure dosages, it suggested that the free Cd2+might be released from CdTe QDs in liver or in kidneys. In summary, the results showed that CdTe QDs could induce toxicity and further pathologic changes of liver and kidneys, which might be positively correlated with the Cd2+released from CdTe QDs in mice.

cadmium telluride quantum dots; cadmium; metallothionein; toxicity; ICR mice

國家自然科學基金項目(81273131)

王萌萌(1988-)，女，首都醫科大學碩士研究生，研究方向為衛生毒理學，E-mail: wangmengmeng1462@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: huangpl@ccmu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20141219001

2014-12-19 錄用日期：2015-01-26

1673-5897(2015)3-256-06

X171.5

A

黃沛力(1963—)，女，無機化學碩士，首都醫科大學教授，博士生導師。長期從事納米材料檢測技術與生物體內化學穩定性研究。

王萌萌，王吉龍，孫湖泊, 等. 碲化鎘量子點Cd2+釋放對小鼠肝、腎組織毒作用的研究[J]. 生態毒理學報，2015, 10(3): 256-261

Wang M M, Wang J L, Sun H B, et al. Hepatotoxicity and nephrotoxicity of cadmium released from cadmium telluride quantum dots in mice [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 256-261(in Chinese)