肝膽兩益湯對失眠模型大鼠不同腦區中單胺類神經遞質的影響

王 燕，張崗強，張 楠，劉 屏（.北京衛生職業學院，北京 0005；.北京中醫藥大學，北京 0009；.首都醫科大學中醫藥學院，北京 00069；.解放軍總醫院臨床藥理研究室，北京 0085）

肝膽兩益湯對失眠模型大鼠不同腦區中單胺類神經遞質的影響

王 燕1，張崗強2，張 楠3，劉 屏4
（1.北京衛生職業學院，北京 100053；2.北京中醫藥大學，北京 100029；3.首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069；4.解放軍總醫院臨床藥理研究室，北京 100853）

[摘要]目的：研究經典古方肝膽兩益湯治療失眠癥的作用機制，為臨床合理使用肝膽兩益湯提供參考。方法：將56只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、地西泮組（0.001 g·kg-1）、百樂眠組（0.215 g·kg-1）和肝膽兩益湯低劑量組（0.925 g·kg-1）、中劑量組（1.850 g·kg-1）和高劑量組（3.700 g·kg-1），采用連續腹腔注射對氯苯丙氨酸（0.3 g·kg-1）造失眠大鼠模型，灌胃肝膽兩益湯治療，運用高效液相-熒光檢測器，檢測大鼠皮層、海馬、紋狀體、下丘腦和腦干內5-HT、DA和NE的含量。結果：與正常組相比，模型組大鼠皮層、海馬、紋狀體、下丘腦和腦干內5-HT含量顯著降低（P < 0.01），下丘腦DA含量顯著降低（P < 0.05），紋狀體和下丘腦NE含量升高（P < 0.05）。經灌胃給予肝膽兩益湯治療后大鼠海馬、皮層、紋狀體和下丘腦內5-HT含量與模型組相比顯著提高，下丘腦內NE含量與模型組相比顯著降低（P < 0.05），其中最佳劑量為1.850 g·kg-1。結論：肝膽兩益湯可調節機體神經內分泌系統，具有顯著的鎮靜催眠和治療失眠的作用。其對失眠治療的可能作用機制是通過增加腦中5-HT含量和降低下丘腦內NE含量。

[關鍵詞]失眠；肝膽兩益湯；單胺類神經遞質

Effect of Gandanliangyitang on monoamine neurotransmitter in different brain regions of insomnia model of rats

WANG Yan1, ZHANG Gang-qiang2, ZHANG Nan3, LIU Ping4
(1. Beijing Health Vocational College, Beijing 100053, China; 2. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China; 3. Capital Medical University School of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100069, China; 4. Department of Clinical Pharmacology, PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

[ABSTRACT] Objective: To study the mechanism of Gandanliangyitang (GDLYT) in the treatment of insomnia and provide reference for clinical use. Methods: A total of 56 SD rats were randomly divided into normal group, model group, diazepam group (0.001 g·kg-1), Bailemian group (0.215 g·kg-1) and GDLYT low dose group (0.925 g·kg-1), middle dose group (1.850 g·kg-1) and high dose group (3.700 g·kg-1). The model of insomnia rats was made successfully by using continuous intraperitoneal injection of parachlorophenylalanine (0.3 g·kg-1). The contents of 5-HT, DA and NE in cortex, hippocampus, corpus striatum, hypothalamus and brainstem of rats were detected by using high performance liquid chromatography with fluorescence detector. Results: Compared with normal group, in model group, the content of 5-HT in rat cortex and hippocampus, striatum, hypothalamus and brainstem significantly decreased (P < 0.01), DA content in the hypothalamus significantly decreased (P < 0.05), NE content increased in striatum and hypothalamus (P < 0.05). Compared with the model group, in GDLYT treatment group, the content of 5-HT in hippocampus, cortex, striatum and hypothalamus increased significantly, NE content in hypothalamus significantly decreased (P < 0.05). The best dose is 1.850 g·kg-1. Conclusion: GDLYT plays remarkable role on sedative hypnotic, the treatment mechanism of insomnia is probably by increasing the 5-HT content in the brain and decreasing the content of NE in hypothalamus, regulating neuroendocrine system.

[KEY WORDS] Insomnia; Gandanliangyitang; Monoamine neurotransmitter

失眠是一種影響健康的常見疾病，不僅影響人類白天正常的工作和生活，還會誘發精神類等疾病，給社會和個人造成極大的負擔。失眠的中醫證候分布以肝郁化火和心脾兩虛為主，初期以肝郁化火為主，后期則以心脾兩虛為主，病機演變過程具有由肝郁化火證→痰熱內擾證→心脾兩虛證的演變規律[1]。《辨證錄》中記載的“肝膽兩益湯”由白芍一兩，遠志五錢，炒棗仁一兩組成。白芍入膽，佐以遠志、棗仁者，既能入心，亦能入膽，則共走膽經，用于治療“夜不能寐，恐鬼祟來侵，輾轉不安或少睡而即驚醒，或再睡而恍如捉拿”等癥。臨床上主要應用于失眠癥的治療，可有效減少多夢和夜間驚醒次數。本文通過測定各組大鼠不同腦區內單胺類神經遞質的含量，研究肝膽兩益湯治療失眠的作用機制，以期在中藥治療失眠上尋求更好的途徑。

1　材料

1.1實驗動物

SD大鼠56只，雄性，體質量180 ~ 220 g，由解放軍總醫院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（京）2011-0004。

1.2實驗藥物與儀器

肝膽兩益湯提取物，取炒酸棗仁破碎，加入其它兩味飲片，加水煎煮3次，每次1 h，合并煎煮液，水浴濃縮，加入乙醇，使醇含量達到50%，濾過，取上清液，回收乙醇并濃縮至浸膏，真空減壓干燥（60 ℃）得干膏，粉碎得干粉。每克干粉相當于4.6 g原生藥材。本品由中國中醫科學院提供，批號：20120703。對氯苯丙氨酸（PCPA），5-羥色胺（5-HT）對照品，多巴胺（DA）對照品，去甲腎上腺素（NE）對照品，均由Sigma公司提供。

1200型Agilent高效液相色譜儀（Agilent公司）；G1321A熒光檢測器（Chemstation色譜工作站，Agilent公司）；3K15型高速冷凍離心機（Sigma公司）；F-30型pH計（北京屹源電子儀器科技公司）；多種規格移液器（Eppendorf公司）；KQ-250E型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

2　方法

2.1PCPA失眠模型的建立

SD大鼠56只，隨機分為正常組、模型組、地西泮組（0.001 g·kg-1）、百樂眠組（0.215 g·kg-1）和肝膽兩益湯低劑量組（0.925 g·kg-1）、中劑量組（1.850 g·kg-1）和高劑量組（3.700 g·kg-1），每組8只。除正常組外，其余各組大鼠每日上午9：00 ~ 9：30腹腔注射PCPA 0.3 g·kg-1，連續注射2 d，正常組腹腔注射與PCPA同體積的弱堿性0.9%氯化鈉注射液。整體觀察，第一次腹腔注射PCPA 28 ~ 30 h后，動物出現晝夜節律消失，白天也活動不停，攻擊性增強，與正常組有明顯差異。

連續兩天腹腔注射PCPA后大鼠運動總路程見表1，結果顯示模型組、地西泮組、百樂眠組和肝膽兩益湯低、中、高劑量組大鼠在大鼠籠內30 min自主運動總路程與正常組相比均有顯著升高（P < 0.05），說明失眠模型建立成功。

表1　連續兩天腹腔注射PCPA后大鼠30 min運動總路程.± sTab 1 The movement distance in 30 minutes after consecutive intraperitoneal injection of PCPA for two days in rats.± s

表1　連續兩天腹腔注射PCPA后大鼠30 min運動總路程.± sTab 1 The movement distance in 30 minutes after consecutive intraperitoneal injection of PCPA for two days in rats.± s

注：與正常組比較，*P < 0.05Note: compared with the normal group,*P < 0.05

組別　例數　運動總路程/m正常組　8　16.786±5.981模型組　8　27.348±10.235*地西泮組　8　25.180±7.002*百樂眠組　8　28.304±9.022*低劑量組　8　23.481±5.989*中劑量組　8　27.421±9.515*高劑量組　8　24.076±7.262*

2.2給藥方法

于第2次腹腔注射PCPA后，按照10 mL·kg-1體重灌胃給藥，正常組給予蒸餾水，地西泮組、百樂眠組和肝膽兩益湯低、中、高劑量組分別灌胃給予相應濃度的藥物連續7 d。

2.3組織樣品的采集

將各組大鼠給藥第6天晚上22：00開始禁食不禁水，第7天早上8：00各組大鼠給藥50 min后進行自主運動視頻錄制，而后用水合氯醛腹腔注射麻醉后眼眶取血，斷頭處死，于冰上迅速剝離大鼠海馬、皮層、紋狀體、下丘腦和腦干，稱重并用錫紙包好，迅速置于液氮中保存，血液室溫靜止1 h后，在4 ℃冷凍離心機上3500 r·min-1離心30 min，取上清即為大鼠血清，然后放于– 80 ℃冰箱保存。

2.4組織提取液的配制

精確取EDTA-Na20.053 3 g、L-半胱氨酸 0.1 g和高氯酸0.787 mL，用100 mL容量瓶定容至100 mL，避光4 ℃保存，備用。

2.5組織樣本的制備

取凍存的大鼠海馬、皮層、紋狀體、下丘腦和腦干組織稱重，按照4 μL·mg-1比例加入組織提取液，冰浴勻漿后冰浴超聲20 min，加入2倍組織重量的90 mmol·L-1磷酸二氫鈉溶液，渦旋混勻后在15 000 r·min-1，4 ℃條件下離心15 min，臨用前取上清液過0.45 μm濾膜。

2.6對照品儲備液制備

精密稱取5-HT、DA、NE對照品各5.0 mg，用組織提取液分別溶解定容至5 mL，搖勻，為1 mg·mL-1各對照品儲備液。從各對照品儲備液中分別吸取適量，用提取液稀釋成5000、1000、500、100、50、10 ng·mL-1的溶液作為混合對照品溶液，避光，4 ℃保存，臨用前經0.45 μm濾膜濾過。

2.7統計學分析

采用SPSS13.0軟件對數據進行分析，實驗數據采用單因素方差分析，組間差異采用Dunnett's后檢驗，計量資料數據用（± s ）表示，以α=0.05作為檢驗水準。

3　結果

3.1HPLC檢測單胺類神經遞質圖譜

色譜圖具體見圖1。

圖1　單胺類神經遞質HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of monoamine neurotransmitter

與混合對照品HPLC色譜圖比較，給藥肝膽兩益湯的失眠大鼠腦組織NE、DA、5-HT含量發生改變。

3.2對照品標準曲線

以各組分對照品溶液濃度為縱坐標（Y），各組分對照品的峰面積為橫坐標（X）繪制標準曲線，見表2。

表2　單胺類神經遞質標準曲線Tab 2 Standard curve of monoamine neurotransmitter

3.3各組大鼠皮層中單胺類神經遞質的含量

與正常組比較，模型組大鼠皮層5-HT含量明顯降低，差異具有顯著統計學意義（P < 0.01），而NE和DA含量均沒有顯著性改變（P > 0.05）；與模型組比較，百樂眠組和肝膽兩益湯低、中、高劑量組大鼠皮層5-HT含量明顯升高，差異均有統計學意義（P < 0.05）。提示肝膽兩益湯各劑量組具有對抗失眠大鼠皮層中5-HT含量降低的作用，其中最佳劑量為1.850 g·kg-1。詳見表3。

表3　肝膽兩益湯對失眠模型大鼠皮層DA、NE、5-HT的影響.± s，n=8Tab 3 Effect of Gandanliangyitang on cortex DA, NE, 5-HT in a rat model of insomnia.± s , n=8

表3　肝膽兩益湯對失眠模型大鼠皮層DA、NE、5-HT的影響.± s，n=8Tab 3 Effect of Gandanliangyitang on cortex DA, NE, 5-HT in a rat model of insomnia.± s , n=8

注：與正常組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；與模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01Note: compared with the normal group,#P < 0.05,##P < 0.01; compared with the model group,*P < 0.05,**P < 0.01

組別　劑量/g·kg-1　NE/ng·g-1　DA/ng·g-1　5-HT/ng·g-1正常組　–　 200.4±59.3 18.2±6.3　 8.8±3.4模型組　–　 172.0±32.2 18.3±3.0　 2.7±1.1##地西泮組　0.001　 168.8±50.4 16.5±4.5　 2.8±1.0百樂眠組　0.215　 183.0±26.6 19.5±6.3　 5.6±1.2*低劑量組　0.925　 180.4±40.1 18.2±3.4　 5.2±2.5*中劑量組　1.850　 215.2±51.2 17.9±2.1　 9.0±2.6**高劑量組　3.700　 175.1±40.9 18.1±3.8　 5.3±1.4*

3.4各組大鼠海馬中單胺類神經遞質的含量

與正常組比較，模型組大鼠海馬5-HT含量明顯降低，差異有顯著統計學意義（P < 0.01），而NE含量沒有顯著性改變（P > 0.05）；與模型組比較，肝膽兩益湯中、高劑量組大鼠海馬中5-HT含量明顯升高，差異有統計學意義（P < 0.05）。由于檢測器的緣故，海馬中DA含量低于最低檢測限，無法測定其含量，故在此未列出，提示肝膽兩益湯具有對抗失眠大鼠海馬中5-HT含量降低的作用。詳見表4。

表4　肝膽兩益湯對失眠模型大鼠海馬NE、5-HT的影響.　± s，n=8Tab 4 Effect of Gandanliangyitang on hippocampus NE, 5-HT in a rat model of insomnia.± s , n=8

表4　肝膽兩益湯對失眠模型大鼠海馬NE、5-HT的影響.　± s，n=8Tab 4 Effect of Gandanliangyitang on hippocampus NE, 5-HT in a rat model of insomnia.± s , n=8

注：與正常組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；與模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01Note: compared with the normal group,#P < 0.05,##P < 0.01; compared with the model group,*P < 0.05,**P < 0.01

組別　劑量/g·kg-1　NE/ng·g-1　5-HT/ng·g-1正常組　–　242.9±50.2　 7.4±0.2模型組　–　242.4±57.6　 4.3±1.2# #地西泮組　0.001　244.7±62.6　 5.1±2.0百樂眠組　0.215　232.9±70.0　 4.9±1.0低劑量組　0.925　239.4±79.5　 4.7±1.4中劑量組　1.850　235.2±58.7　 6.0±0.9*高劑量組　3.700　239.9±58.3　 6.2±1.0**

3.5各組大鼠下丘腦中單胺類神經遞質的含量

與正常組比較，模型組大鼠下丘腦NE含量顯著升高（P < 0.05），DA及5-HT含量顯著降低（P < 0.01）。與模型組比較，地西泮組、百樂眠組和肝膽兩益湯低、中、高劑量組大鼠下丘腦NE含量明顯降低，差異有統計學意義（P < 0.05）；地西泮組和肝膽兩益湯低、中、高劑量組與模型組相比5-HT含量明顯升高，差異均有統計學意義（P < 0.05）。詳見表5。

表5　肝膽兩益湯對失眠模型大鼠下丘腦NE、DA和5-HT的影響.± s ，n=8Tab 5 Effect of Gandanliangyitang on hypothalamus NE, DA, 5-HT in a rat model of insomnia.　± s , n=8

表5　肝膽兩益湯對失眠模型大鼠下丘腦NE、DA和5-HT的影響.± s ，n=8Tab 5 Effect of Gandanliangyitang on hypothalamus NE, DA, 5-HT in a rat model of insomnia.　± s , n=8

注：與正常組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；與模型組比較，*P < 0.05,**P < 0.01Note: compared with the normal group,#P < 0.05,##P < 0.01; compared with the model group,*P < 0.05,**P < 0.01

組別　劑量/g·kg-1　NE/ng·g-1　DA/ng·g-1　5-HT/ng·g-1正常組　–　 106.5±17.0　237.8±49.1　 7.4±1.5模型組　–　 137.6±24.8#　133.7±35.5##2.6±1.6##地西泮組　0.001 113.7±25.9*　144.8±42.3　 5.0±1.8*百樂眠組　0.215 113.2±13.3*　137.7±84.3　 3.8±1.0低劑量組　0.925 109.5±11.3*　108.0±92.8　 4.4±1.1*中劑量組　1.850 106.2±21.2*　131.7±68.8　 4.5±1.2*高劑量組　3.700 101.7±24.8*　139.9±38.3　 5.4±1.6**

3.6各組大鼠紋狀體中單胺類神經遞質的含量

與正常組比較，模型組大鼠紋狀體NE含量顯著升高（P < 0.05），DA含量沒有顯著變化（P > 0.05），5-HT含量顯著降低（P < 0.01）。與模型組比較，各個給藥組對NE含量均沒有顯著性影響；肝膽兩益湯低、中、高劑量組與模型組相比5-HT含量明顯升高，差異均有統計學意義（P < 0.05）。詳見表6。

表6　肝膽兩益湯對失眠模型大鼠紋狀體NE、DA和5-HT的影響.± s ，n=8Tab 6 Effect of Gandanliangyitang on the corpus striatum NE, DA, 5-HT in a rat model of insomnia.　± s , n=8

表6　肝膽兩益湯對失眠模型大鼠紋狀體NE、DA和5-HT的影響.± s ，n=8Tab 6 Effect of Gandanliangyitang on the corpus striatum NE, DA, 5-HT in a rat model of insomnia.　± s , n=8

注：與正常組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；與模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01Note: compared with the normal group,#P < 0.05,##P < 0.01; compared with the model group,*P < 0.05,**P < 0.01

組別　劑量/g·kg-1　NE/ng·g-1　DA/ng·g-1　5-HT/ng·g-1正常組　–　278.8±98.1　 20 655.5±3 891.0 4.3±1.2模型組　–　498.9±124.3#18 127.3±2 784.0 1.9±0.6##地西泮組　0.001　552.0±156.9 16 261.6±2 549.0 1.7±0.5百樂眠組　0.215　569.6±190.1 17 667.0±2 354.0 4.2±0.9**低劑量組　0.925　597.5±188.3 16 198.8±2 738.0 3.1±0.7*中劑量組　1.850　464.7±123.5 15 431.6±2 066.0 2.6±0.5*高劑量組　3.700　535.4±178.9 15 055.0±2 197.0 4.2±0.8**

3.7各組大鼠腦干中單胺類神經遞質的含量

與正常組比較，模型組大鼠腦干NE含量有所升高，DA含量有所降低，但均無統計學意義（P > 0.05），5-HT含量顯著降低（P < 0.01）。與模型組比較，各個給藥組對NE、DA和5-HT含量均沒有顯著性影響（P > 0.05）。詳見表7。

表7　肝膽兩益湯對失眠模型大鼠腦干NE、DA和5-HT影響.　± s ，n=8Tab 7 Effect of Gandanliangyitang on brainstem NE, DA, 5-HT in a rat model of insomnia.　± s , n=8

表7　肝膽兩益湯對失眠模型大鼠腦干NE、DA和5-HT影響.　± s ，n=8Tab 7 Effect of Gandanliangyitang on brainstem NE, DA, 5-HT in a rat model of insomnia.　± s , n=8

注：與正常組比較，#P < 0.05，##P < 0.01Note: compared with the normal group,#P < 0.05,##P < 0.01

組別　劑量/g·kg-1　NE/ng·g-1　DA/ng·g-1　5-HT/ng·g-1正常組　–　194.9±52.9　996.3±103.3　7.2±1.7模型組　–　255.2±65.9　974.4±171.2　4.1±1.8##地西泮組　0.001　277.4±98.3 1 005.0±94.5　5.0±2.1百樂眠組　0.215　282.2±102.6　940.2±150.5　4.9±1.2低劑量組　0.925　238.3±82.5　1 100.0±295.6　4.6±2.3中劑量組　1.850　261.5±81.9　985.8±260.2　4.4±1.5高劑量組　3.700　239.5±84.2　1 153.9±118.2　5.2±2.4

4　討論

5-HT對于睡眠的發生和維持起到關鍵性的作用，主要存在紋狀體中，其次為基底節、下丘腦、黑質、垂體及新皮層[2]。用PCPA抑制腦內5-HT合成時能引起動物的完全性失眠，且因5-HT耗竭而導致動物腦內其他單胺類神經遞質含量發生紊亂，大鼠腹腔注射PCPA 28 ~ 30 h后，晝夜睡眠節律消失，白天也活動不停，而給予5-HT前體物5-羥色氨酸后，動物完全恢復正常睡眠[3]。5-HT對于睡眠的發生和維持主要與慢波睡眠（SWS）有關，以電流直接損毀動物中縫核5-HT能神經元時，SWS消失[4]。DA主要存在前額葉皮層、杏仁核、嗅球、海馬、丘腦和中腦[5]，腦內DA濃度增高時，腦電波出現低幅快波，即興奮性的表現[6]。中樞NE對中樞神經既有興奮又有抑制作用，但主要以興奮作用為主，可降低大腦皮質的興奮性[7]。其各自含量的平衡對于睡眠的調節起到至關重要的作用，大腦的各個部位對于睡眠的調節有不同的作用，其中海馬、紋狀體、下丘腦、腦干和皮層中都含有與睡眠密切相關的單胺類神經遞質[8]。

本實驗結果顯示，連續兩天腹腔注射PCPA造失眠模型成功后，大鼠皮層、海馬、紋狀體、下丘腦和腦干中5-HT水平較正常組顯著降低；下丘腦部位DA含量顯著降低；下丘腦和紋狀體部位NE含量顯著升高。提示PCPA造失眠模型時，主要影響的是5-HT含量，所檢測腦各部位的5-HT含量均有一定程度的降低，伴隨5-HT含量降低，DA和NE的含量也有一定程度的改變。因此，可推測PCPA失眠模型在5-HT耗竭的同時伴隨著紋狀體和下丘腦部位DA和NE的改變，從而導致失眠大鼠腦內單胺類神經遞質紊亂而失眠。

·臨床藥師園地·

[作者簡介]王燕，女，講師，研究方向：中藥藥理。E-mail：mandy_wang_2004@163.com

[通信作者]劉屏，女，研究員，研究方向：中藥藥理學。E-mail：liuping301@126.com

[基金項目]軍隊中醫藥科研專項課題（10ZYZ141）

[中圖分類號]R96

[文獻標識碼]A

[文章編號]1672 – 8157(2015)04 – 0215 – 05