正交試驗優選黃芩苷血藥濃度測定中大鼠血漿的處理條件Δ

李海龍，孫 妍，姚 琳，馮文成，胡 昊，王偉明（黑龍江省中醫藥科學院，哈爾濱 150036）

黃芩苷是黃芩的活性成分之一，有清熱解毒、抑菌抗炎等功效[1]。因黃芩苷具有廣泛的藥理作用，所以一直有著良好的臨床應用價值；但其脂溶性差，體內吸收率比較低，生物利用度差。因此，為了提高黃芩苷的生物利用度，黃芩苷的藥動學研究一直是受到關注較多的課題[2]。作為中藥復方拆方藥動學的前期研究，本課題組通過對大鼠血漿中黃芩苷的處理方法進行研究，選出最優處理方法，為黃芩苷的藥動學研究提供了處理方法依據。

1 材料

1.1 儀器

E2695型高效液相色譜（HPLC）儀、2489型紫外檢測器（美國Waters公司）；BSA224S-CW型電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；SK250H型超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司）；LG16-W 型高速臺式離心機（北京京立離心機有限公司）；WH-3 微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器有限公司）；Milli-Q Reference System型超純水器（美國Millipore 公司）。

1.2 試劑

黃芩苷對照品（批號：110715-201016，純度：≥98%）、蘆丁對照品（批號：100080-200306，純度：91%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，美國Dikma 公司）；其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

2 方法與結果

2.1 色譜條件[3-4]

色譜柱：WATERS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.04%磷酸水溶液（38 ∶62，V/V），流速：1.0 ml/min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。理論板數按黃芩苷計不少于3 000，黃芩苷與內標及其他雜質峰分離良好。

2.2 溶液的制備

精密稱取黃芩苷對照品2.8 mg、蘆丁對照品7.9 mg，分別置于25、50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，得質量濃度分別為112、158 μg/ml的黃芩苷、蘆丁貯備溶液，4 ℃貯藏，備用。

2.3 血漿樣品的采集

取Wistar 大鼠10 只，每只腹主動脈采血10 ml，置于肝素鈉負壓采血管中，以離心半徑為4 cm、4 000 r/min離心15 min，分離血漿，置于－20 ℃貯藏，備用。

2.4 血漿樣品的處理

于同一離心管中加入一定量的蘆丁液（內標，158 μg/ml）、1 ml黃芩苷對照品溶液（112 μg/ml），氮氣流下吹干，精密加入血漿樣品200 μl混勻。按正交試驗表進行血漿樣品處理：加入磷酸、甲醇，渦旋，混合2 min，超聲一定時間萃取，以離心半徑為4 cm 第1 次離心一定時間（除蛋白沉淀），取上清液氮氣流下吹干，加200 μl流動相復溶，渦旋混合1 min，以離心半徑為3 cm 第2 次離心一定時間（除血漿中雜質）。每組3 個平行樣品。處理完成后取上清液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以測定量與加入量之比計算黃芩苷萃取回收率。

2.5 正交試驗設計[5-9]

以黃芩苷萃取回收率為評價指標，以磷酸量（A）、甲醇量（B）、超聲萃取時間（C）、離心轉速1（D）、離心時間1（E）、離心轉速2（F）、離心時間2（G）為考察因素，采用L18（37）正交表進行試驗。因素與水平見表1；正交試驗結果見表2；方差分析結果見表3。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗結果Tab 2 Results of orthogonal test

由表2、表3 可知，各因素對試驗結果的影響程度依次為A＞B＞G＞C＞E＞D＞F，血漿處理方法最優條件為A2B3C2D1E2F3G1，即加入磷酸50 μl、甲醇2 000 μl，渦旋混合2 min，超聲萃取10 min，以離心半徑為4 cm、3 000 r/min離心10min，取上清液于氮氣流下吹干，取200 μl流動相復溶，渦旋混合1 min，以離心半徑為3 cm、14 000 r/min 離心5 min。以極值最小的F因素為誤差項進行方差分析，結果表明A、B、C、E、G，即加入磷酸量、甲醇量、超聲萃取時間、離心時間對血漿中黃芩苷的萃取有顯著影響，且A＞B＞G＞C＞E。

表3 方差分析結果Tab 3 Results of variance analysis

2.6 驗證試驗

為了確保提取工藝的重現性及可行性，于同一離心管中加入一定量的蘆丁液（內標）、1 ml黃芩苷對照品溶液，氮氣流下吹干，精密加入血漿樣品200 μl混勻，平行5份，按血漿樣品方法處理下最優條件操作，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，計算黃芩苷萃取回收率。結果，5 份平行樣品的黃芩苷平均萃取回收率均高于正交試驗組，表明處理條件為最優條件；且5 份平行樣品的萃取回收率較為接近，表明按最優處理方法處理大鼠血漿樣品比較穩定。驗證試驗結果見表4。

表4 驗證試驗結果Tab 4 Results of validation test

3 討論

通過測定正交試驗黃芩苷的萃取回收率，在加入磷酸50 μl、甲醇2 ml，渦旋混合2 min，超聲萃取10 min，以離心半徑為4 cm、3 000 r/min 離心10 min，取上清液氮氣流下吹干，取200 μl流動相復溶，渦旋混合1 min，以離心半徑為3 cm、14 000 r/min離心5 min的條件下，應用HPLC法測定黃芩苷的峰形最好，血漿中的黃芩苷萃取回收效果最高。通過正交試驗方差分析得出，加入磷酸量、甲醇量、超聲萃取時間、離心時間對血漿中黃芩苷萃取回收影響顯著。利用最優萃取工藝，可最大限度萃取血漿中黃芩苷。

為了減少試驗過程中的誤差，在樣品處理時，采用內標法，以蘆丁為內標物；通過參考文獻，在血漿樣品的處理時，通常采用甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑對血漿蛋白沉淀處理，蘆丁和黃芩苷在甲醇中有較好的溶解率，且本研究中HPLC 色譜條件水相為甲醇-磷酸水溶液，所以采用甲醇對樣品中血漿蛋白進行沉淀。通過最佳樣品處理方法，樣品中黃芩苷和蘆丁的萃取回收率均能達到80%以上，且方法穩定可行，符合要求[10]。

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