黃芪多糖緩釋纖維對成骨細胞MC3T3-E1增殖分化的影響

王相峰，劉童斌，陳亞丹，付秀娟（.吉林大學第二醫院，長春 3004；.吉林大學口腔醫院，長春 3004）

黃芪多糖（Astragalus polysaccharides，AP）是黃芪中最重要的天然有效成分。隨著對多糖研究的深入，發現多糖具有多方面的生物活性及功能。AP也因其在抗骨質疏松、增強機體免疫力、抗衰老、降血糖等方面有較強的活性而備受關注[1-2]。有研究報道，黃芪水提液能夠促進骨形成[3]，AP能促進大鼠原代成骨細胞的增殖、分化與礦化[4-5]，適宜濃度的AP 在短期內對體外牙周膜細胞的增殖也具有一定的促進作用[6-9]。

臨床上中老年患者行種植牙手術時，其骨量骨質的條件往往不理想。目前，最理想的骨修復方式是自體骨移植，但供需骨的喪失和二次手術等缺陷限制了其應用[10]。組織工程技術作為一種新的再生模式，為牙周骨缺損的修復重建提供了新思路。左旋聚乳酸（PLLA）是一種可降解生物高分子材料，具有機械性能良好、可降解等特點，被廣泛應用于醫療行業；電紡絲作為一種新興的技術手段，操作簡易，可制備包裹有效藥物成分的可控、緩釋藥物的復合材料。乳液法電紡絲技術是基于高壓靜電紡絲發展而來，將藥物加入靜電紡絲纖維中，藥物分散均勻，緩釋效果較好，且具備經濟實惠、制備方法簡單的優勢。因此，本研究將AP 與PLLA 結合制成AP 緩釋纖維，通過考察AP 緩釋纖維的體外釋放以及其對成骨細胞MC3T3-E1的黏附、增殖和分化的影響，初步探討AP緩釋纖維用于種植體周骨缺損修復的可行性。

1 材料

1.1 儀器

靜電紡絲推進裝置（北京鎧為信科技有限公司）；超純水儀（美國Millipore 公司）；HZQ-X100 型恒溫震蕩培養箱（哈爾濱東聯電子技術開發有限公司）；Micrion FEI PHILIPS場發射掃描電子顯微鏡（美國FEI公司）；TU-1810紫外-可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；TGL-16G-A離心機（上海安亭公司，離心半徑：3.5 cm）；MCO-18AIC（UV）型CO2培養箱（日本三洋電機株式會社）；倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；恒溫水浴箱（上海醫療器械五廠）。

1.2 藥品與試劑

PLLA（上海麗昂化學有限公司，批號：320140124，純度：＞95%）；AP（南京景竹生物科技有限公司，批號：20131022，純度：90%）；胰酶（寶泰克生物有限公司，批號：20140411，分析純）；高糖達爾伯克改良伊格爾（DMEM）培養基（美國Gibco 公司，批號：126H4526D）；MTT（寶泰克生物有限公司，批號：20131102，分析純）；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20140523）；異硫氰酸熒光素（FITC，美國Sigma 公司，批號：F1407295）；磷酸鹽緩沖液（PBS，長春匯力生物技術有限公司，批號：720140625）；二甲基亞砜（DMSO）、碘化丙啶（PI）、三氯甲烷，油酸山梨坦等試劑均為分析純，購自北京化工廠。

1.3 細胞

小鼠成骨細胞MC3T3-E1 細胞系由中國科學院細胞庫提供。

2 方法

2.1 緩釋纖維的制備

常溫下用8 ml三氯甲烷溶解1 g PLLA，充分溶解后，加入3 mlN，N-二甲基甲酰胺、30 μl油酸山梨坦，攪拌均勻作為外油相。將AP 溶于PBS 中制備成質量濃度分別為0、25、50、100 μg/ml 的溶液，作為內水相。將0.5 ml 內水相逐滴加至外油相中，采用磁力攪拌30 min，形成W/O型乳液。將乳液加入靜電紡絲推進裝置，加高壓靜電20 kV，室溫下靜電紡織為纖維薄膜，晾干，制得緩釋纖維。分別依次記為PLLA（0 μg/ml AP）、PLLA/AP1（25 μg/ml AP）、PLLA/AP2（50 μg/ml AP）、PLLA/AP3（100 μg/ml AP），備用。

2.2 緩釋纖維的形態觀察

將PLLA、PLLA/AP1、PLLA/AP2、PLLA/AP3 分別裁剪成5 mm×5 mm大小，將纖維樣品固定在導電膠上，經過噴金后，在掃描電子顯微鏡下觀察其表面形態，電子加速率為15 kV。

2.3 緩釋纖維的AP體外釋放試驗

精密稱量PLLA/AP1、PLLA/AP2、PLLA/AP3 各0.2 g，分別浸泡在裝有10 ml 模擬體液的塑料管中，37 ℃水浴震蕩，分別于1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 d取出浸提液，然后加入同溫度同體積的模擬體液。將取出的浸提液采用苯酚-濃硫酸法顯色，在490 nm波長處測定AP的吸光度，計算釋放度[11]，繪制體外釋放曲線。

2.4 細胞在AP緩釋纖維上的黏附考察

將FITC混入AP質量濃度為50 μg/ml的內水相中，使其質量濃度為1 μg/ml，其余步驟同“2.1”項下方法制備成AP 緩釋纖維，記為PLLA/AP/FITC。使用特制打孔器在PLLA/AP/FITC 上取直徑為30 mm 的纖維膜，正反面分別進行紫外線照射消毒。纖維膜用MC3T3-E1 細胞培養液浸泡1 h 后，置于6孔板中，將MC3T3-E1 細胞（1.0×105個/孔）接種于纖維膜上。將6 孔板置于37 ℃下含5%CO2細胞培養箱中培養4 h，用PI染色，置于熒光顯微鏡下觀察MC3T3-E1 細胞在AP 緩釋纖維上的黏附情況。

2.5 緩釋纖維對MC3T3-E1細胞增殖的影響

試驗分為4 組，即PLLA 組、PLLA/AP1 組、PLLA/AP2 組、PLLA/AP3 組。使用特制打孔器在PLLA、PLLA/AP1、PLLA/AP2、PLLA/AP3纖維膜上分別取得直徑為8 mm的纖維膜，每組6 份，將纖維正反面紫外線照射消毒后置于96 孔板內，將MC3T3-E1細胞（4×103個/孔）接種于纖維膜上，將96孔板置于37 ℃下含5%CO2的細胞培養箱中培養。分別在24、48、72 h時每孔加入20 μl MTT，放入培養箱繼續培養4 h后，將培養液吸出，每個樣品加入DMSO 150μl，室溫下振蕩10 min，加樣于96 孔板中，用酶標儀測定570 nm 波長處的光密度，考察MC3T3-E1細胞的增殖情況。

2.6 緩釋纖維對MC3T3-E1細胞中ALP活性的影響

試驗分組同“2.5”項。使用特制打孔器在PLLA、PLLA/AP1、PLLA/AP2、PLLA/AP3 纖維膜上分別取直徑15 mm 的纖維膜，每組6份，將纖維正反面紫外線照射消毒后置于24孔板內，將MC3T3-E1細胞（1×104個/孔）接種于纖維膜上，將24孔板置于37 ℃下含5%CO2的細胞培養箱中培養。分別在3、5、7 d時用0.25%胰蛋白酶消化2 min，加培養液終止消化。將所有液體及細胞轉入EP 管，1 000 r/min 離心10 min，棄上清，留沉淀細胞，加入1 ml PBS輕輕吹打，再次離心10 min，棄上清，在細胞沉淀中加入200 μl PBS，反復凍融3次。按ALP試劑盒操作步驟加樣于96孔板中，用酶標儀測定520 nm波長處的光密度，計算ALP活性。

2.7 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，采用SigmaPlot 12.5軟件作圖。結果以表示，組間采用t檢驗。檢驗標準α＝0.05，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 緩釋纖維形態學表現

掃描電鏡圖中顯示，PLLA 可見纖維連續，彼此有較多空隙，表面光滑；PLLA/AP1、PLLA/AP2、PLLA/AP3 的纖維呈縱橫交錯的三維、多空網絡結構，與PLLA 比較纖維的粘連程度降低，直徑均一性降低，且3 種AP 載藥量下纖維形態未見明顯改變。掃描電鏡圖見圖1。

圖1 掃描電鏡圖（×500）Fig 1 Fluorescence microgram（×500）

3.2 體外釋放試驗結果

結果顯示，PLLA/AP1、PLLA/AP2、PLLA/AP3 中AP 第1天的累積釋放度分別為37%、38%、40%，第7天的累積釋放度分別為72%、73%、75%，第21 天的累積釋放度均在90%左右。表明第1 周AP 釋放較快，隨后釋放速率減慢。在最初的1 d 內，AP 的釋放呈現一種突釋狀態，其中PLLA/AP3 較PLLA/AP1 和PLLA/AP2 的釋藥速度略快。AP 緩釋纖維的藥物釋放曲線見圖2。

圖2 AP緩釋纖維的藥物釋放曲線Fig 2 Drug release curve of AP sustained-release fiber

3.3 細胞在PLLA/AP/FITC上的黏附情況

結果顯示，MC3T3-E1 細胞能在PLLA/AP/FITC 上黏附生長，呈不規則多邊形，細胞與纖維結合牢固。熒光顯微鏡圖見圖3。

圖3 熒光顯微鏡圖（×400）Fig 3 Fluorescence microgram（×400）

3.4 MC3T3-E1細胞的增殖情況

與PLLA 比較，PLLA/AP2、PLLA/AP3 能促進MC3T3-E1細胞的增殖，而PLLA/AP1僅作用48 h時能促進MC3T3-E1細胞的增殖，差異具有統計學意義（P＜0.05），且作用與AP 質量濃度呈正相關。各組MC3T3-E1細胞的增殖情況見表1。

表1 各組MC3T3-E1細胞的增殖情況（，n＝6）Tab 1 The proliferation of MC3T3-E1 in each group（，n＝6）

表1 各組MC3T3-E1細胞的增殖情況（，n＝6）Tab 1 The proliferation of MC3T3-E1 in each group（，n＝6）

注：與PLLA組比較，＊P＜0.05Note：vs.PLLA group，＊P＜0.05

3.5 MC3T3-E1細胞中ALP活性的變化

與PLLA 比較，PLLA/AP1、PLLA/AP2、PLLA/AP3 均能增強MC3T3-E1 細胞中ALP 活性表達，差異具有統計學意義（P＜0.05），且與AP 濃度呈正相關。各組MC3T3-E1 細胞中ALP活性表達情況見表2。

表2 各組MC3T3-E1細胞中ALP活性表達情況（，n＝6，u/L）Tab 2 Expression of ALP in MC3T3-E1 each group（，n＝6，u/L）

表2 各組MC3T3-E1細胞中ALP活性表達情況（，n＝6，u/L）Tab 2 Expression of ALP in MC3T3-E1 each group（，n＝6，u/L）

注：與PLLA組比較，＊P＜0.05Note：vs.PLLA group，＊P＜0.05

4 討論

大量基礎研究表明，AP卓越的促成骨功能使之具有較好的臨床應用前景[3-9]。孔祥鶴等[5]的研究發現不同質量濃度（0.1、0.3、1、3、10、30、100 μg/ml）的AP能夠促進大鼠原代成骨細胞的增殖、分化及礦化。劉豫蓉等[4]分別用0.08、0.1、0.2、0.4 mg/ml的AP作用于體外培養新生大鼠顱骨成骨細胞，發現AP在短期內對體外成骨細胞的增殖與分化具有一定的促進作用。許春姣等[8]的研究發現，AP（50 μg/ml）與殼聚糖/聚乳酸制成復合材料能夠促進犬牙周缺損部位的骨形成。為此，本研究選擇25、50、100 μg/ml 的AP 與PLLA 相結合，制備AP 緩釋纖維。

AP緩釋纖維在模擬體液的作用下，PLLA緩慢降解，AP不斷從纖維表面釋放出來。AP緩釋纖維的體外釋放試驗結果表明，釋放大致分為兩個階段，即突釋期和穩定期。第1天AP累積釋放度約為40%；第2～5天進入釋放穩定期，每天釋放量約為10%。此時纖維表面形成的孔洞有利于藥物進一步緩慢釋放，AP 的釋放呈現相對規律的狀態。5 d 后，釋放速率進一步降低。筆者推測：最初的突釋狀態可能是由于纖維表面AP的釋放以及纖維所具有的高比表面積所引起的，而隨后的平穩緩慢釋放則是因為伴隨著PLLA 的緩慢降解，從而AP 緩慢釋放。這說明AP 緩釋纖維具有良好的緩釋效果。另外藥物濃度與釋放速率呈現一定程度的正相關。筆者認為：隨著載藥量的增加，釋藥速率增大，一是因為載藥量大的纖維單位體積內AP 濃度高、藥物擴散的濃度梯度大，這就更有利于纖維上的藥物擴散、溶解到釋放介質中[12]；二是因為載藥量大的纖維，靠近表面的AP 增多，其首先釋放完畢，在纖維表面形成較多的孔道，使得纖維內部的AP 擴散出來的幾率增大[13]。從整個過程來看，AP緩釋纖維可對AP起到緩釋作用。

MC3T3-E1 細胞具有體外培養成骨細胞的各種生物學特性，是研究藥物對成骨細胞影響的理想的體外細胞模型[14]。利用熒光染色可見MC3T3-E1 細胞在AP 緩釋纖維上黏附生長，呈不規則的多邊形，偽足伸展充分，細胞生長狀態較好；但細胞間沒有緊密聯系，沒有形成細胞團片。通過MTT比色分析發現，各PLLA/AP組能夠顯著地促進MC3T3-E1細胞的增殖，尤其是PLLA/AP3 組在各時間段均具有顯著的促增殖作用（P＜0.05），說明AP緩釋纖維能夠有效促進MC3T3-E1細胞的增殖。ALP 是成骨細胞所分泌的一種酶蛋白，其高表達是成骨細胞分化成熟的早期標志。本研究表明，ALP的活性與AP的濃度成正比，隨著AP濃度的增加，MC3T3-E1細胞ALP活性顯著增加。該結果提示AP緩釋纖維能夠有效促進MC3T3-E1細胞的分化（P＜0.05）。

本研究表明，靜電紡絲制備的AP緩釋纖維具有一定的AP緩釋能力，表面可以黏附MC3T3-E1細胞，并對細胞增殖、分化有促進作用。其制備過程簡便、易于儲存，因此有望應用于老年人種植體周骨缺損的修復，但仍需進行動物實驗以進一步驗證其可行性。

[1]張薔，高文遠，滿淑麗.黃芪中有效成分藥理活性的研究進展[J].中國中藥雜志，2012，31（21）：3 203.

[2]梁麗娟，屠鵬飛，趙奎君.黃芪多糖的藥理作用研究進展[J].中國藥房，2010，21（43）：4 113.

[3]劉念，程澤能，李煥德.抗骨質疏松藥物研究進展[J].中國新藥雜志，2004，13（12）：1 243.

[4]劉豫蓉，張朝良，孔祥麗，等.黃芪多糖對成骨細胞增殖分化和結構的影響[J].國際口腔醫學雜志，2010，37（2）：133.

[5]孔祥鶴，牛銀波，王婷梅，等.黃芪多糖對大鼠原代成骨細胞的影響及其機制研究[J].中草藥，2011，42（10）：2 065.

[6]張朝良，孔祥麗，陳思秀，等.黃芪多糖對牙周膜細胞增殖與結構的形態學影響[J].華西口腔醫學雜志，2010，28（5）：556.

[7]常立娜，屈樹新，林孫忠，等.載黃芪多糖羥基磷灰石的制備及生物學性能評價[J].無機材料學報，2011，26（1）：22.

[8]許春姣，翦新春，郭峰，等.黃芪多糖/殼聚糖/聚乳酸為支架的組織工程骨修復牙周組織缺損的實驗研究[J].中國修復重建外科雜志，2007，21（7）：748.

[9]許春姣，郭峰，高清平，等.骨髓基質干細胞與黃芪-殼聚糖/聚乳酸支架對犬牙周骨缺損再生的影響[J].中南大學學報：醫學版，2006，31（4）：512.

[10]Xu HH，Quinn JB，Takagi S，et al.Synergistic reinforcement of in situ hardening calcium phosphate composite caffold for bone tissue engineering[J].Biomaterials，2004，25（6）：1 029.

[11]藍永鋒，歐國燈.苯酚硫酸法測定黃芪中多糖含量[J].藥物與人，2014，27（8）：14.

[12]Kim GH，Yoon H，Park YK.Drug release from various thicknesses of layered mats consisting of electrospun polycaprolactone and polyethylene oxide micro/nanofiber[J].Appl Phys A，2010，100（4）：1197.

[13]蔣巖巖，秦靜雯，錢偉偉，等.載藥聚乳酸絲素/納米纖維的制備及緩釋性能[J].紡織學報，2012，33（11）：15.

[14]Chen LL，Lei LH，Ding PH，et al.Osteogenic effect of drynariae rhizoma extracts and naringin on MC3T3-E1 cells and an induced rat alveolar bone resorption model[J].Arch Oral Biol，2011，56（12）：1 655.