蛇葡萄素鈉協(xié)同卡鉑對(duì)人肺腺癌GLC-82細(xì)胞增殖的抑制作用

張艷霞，吳勇杰，李文廣（1.甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心，蘭州 730000；.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)研究所/甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000）

蛇葡萄素（Ampelopsin）為存在于葡萄科、楊梅科、杜鵑科、藤黃科、大戟科及柳科等植物中的一種重要的黃酮類(lèi)化合物[1]。蛇葡萄素鈉（Ampelopsin sodium，AMP-Na）為蛇葡萄素高水溶性鈉鹽，是甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室為了提高蛇葡萄素的溶解性及穩(wěn)定性，使其更適合臨床使用而制備的一種化合物[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，蛇葡萄植物具有抑制酪氨酸酶活性[3]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[4-7]，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍關(guān)注。但是，AMP-Na 與化療藥物卡鉑聯(lián)用對(duì)人肺腺癌GLC-82 細(xì)胞是否有抑制作用？作用機(jī)制是什么？尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。為此，本研究考察了AMP-Na單用及與卡鉑聯(lián)用對(duì)人肺腺癌GLC-82細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制、誘導(dǎo)凋亡作用，以探討其抗腫瘤作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

Coulter EpicsXL 型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman-Coulter 公司）；IX31 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；2306 型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Shellab公司）；SW-CJ-IFD型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；ELX800 型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）。

1.2 藥品與試劑

AMP-Na注射用無(wú)菌粉末（批號(hào)：051115，純度：98.8%，規(guī)格：50 mg/支）、AMP-Na 注射用無(wú)菌粉末專(zhuān)用稀釋液（批號(hào)：051118，pH 6.8，規(guī)格：5 ml/支）均購(gòu)自廣東泰禾醫(yī)藥科技有限公司；注射用卡鉑無(wú)菌粉末（齊魯制藥有限公司，批號(hào)：6120152DA，規(guī)格：100 mg/支）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程有限公司，批號(hào)：050126）；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；MTT（美國(guó)Fluka公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)胞

人肺腺癌GLC-82 細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GLC-82細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104ml－1，以90 μl/孔加入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后加入藥物10 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。試驗(yàn)以3.12、6.25、12.5、25、50 μg/ml 卡鉑，25、50、100 μg/ml AMP-Na，3.12、6.25、12.5、25、50 μg/ml 卡鉑+25、50、100 μg/ml AMP-Na 聯(lián)合作用于GLC-82 細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照（僅常規(guī)培養(yǎng)液）組、陰性對(duì)照（細(xì)胞+培養(yǎng)液）組。于試驗(yàn)終止前4 h加入MTT（10 μl/孔），試驗(yàn)終止時(shí)加入10% 十二烷基硫酸鈉（SDS，100 μl/孔），置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜。次日于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定光密度（OD），按下式計(jì)算抑制率。抑制率（IR，%）＝{[（陰性對(duì)照組OD－空白對(duì)照組OD）－受試藥組OD]/（陰性對(duì)照組OD－空白對(duì)照組OD）}×100%。每板各質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

2.2 各組活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞占比的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GLC-82 細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640 完全培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×105ml－1，以9 ml/瓶接種于10 個(gè)培養(yǎng)瓶。試驗(yàn)分為陰性對(duì)照（常規(guī)培養(yǎng)液）組，卡鉑（25 μg/ml）組，AMP-Na①、②、③、④（12.5、25、50、100 μg/ml）組與聯(lián)合用藥①、②、③、④（AMP-Na 12.5、25、50、100 μg/ml+卡鉑25 μg/ml）組。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，分別以1 ml/瓶加入藥物或生理氯化鈉溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，制備樣本，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。公式：細(xì)胞占比（%）＝活細(xì)胞或凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組細(xì)胞增殖抑制率的檢測(cè)結(jié)果

質(zhì)量濃度在25～100 μg/ml范圍內(nèi)時(shí)，AMP-Na對(duì)GLC-82細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)；質(zhì)量濃度在50～100 μg/ml 范圍內(nèi)，AMP-Na 對(duì)3.12、6.25、12.5、25、50 μg/ml卡鉑抑制GLC-82細(xì)胞增殖具有協(xié)同效應(yīng)。各組細(xì)胞增殖抑制率的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1（表中AMP-Na 0 μg/ml+卡鉑0 μg/ml為陰性對(duì)照）。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率的檢測(cè)結(jié)果（，n＝3，%）Tab 1 The inhibitory rate of Amp-Na to cell proliferation in each group（，n＝3，%）

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率的檢測(cè)結(jié)果（，n＝3，%）Tab 1 The inhibitory rate of Amp-Na to cell proliferation in each group（，n＝3，%）

注：與陰性對(duì)照比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；與相應(yīng)質(zhì)量濃度卡鉑比較，#P＜0.01Note：vs.negative control，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.the corresponding concentration carboplatin，#P＜0.01

3.2 各組活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞占比的檢測(cè)結(jié)果

與陰性對(duì)照組比較，卡鉑組，AMP-Na④組與聯(lián)合用藥①、③、④組活細(xì)胞占比減少，凋亡細(xì)胞占比增加；卡鉑組，AMP-Na③、④組與聯(lián)合用藥①、②、③、④組壞死細(xì)胞占比增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。與卡鉑組比較，聯(lián)合用藥①、③、④組活細(xì)胞占比減少，凋亡細(xì)胞占比增加；聯(lián)合用藥③、④組壞死細(xì)胞占比增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05）。各組活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞占比的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2；各組細(xì)胞凋亡和壞死變化見(jiàn)圖1。

表2 各組活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞占比的檢測(cè)結(jié)果（，n＝4）Tab 2 The proportion of living cell，apoptosis cell and dead cell in each group（，n＝4）

表2 各組活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞占比的檢測(cè)結(jié)果（，n＝4）Tab 2 The proportion of living cell，apoptosis cell and dead cell in each group（，n＝4）

注：與陰性對(duì)照組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；卡鉑組比較，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.negative control group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.carboplatin group，#P＜0.05，##P＜0.01

4 討論

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）占肺癌發(fā)病率的80%左右。由于其發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已屬晚期，喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)，且預(yù)后較差，故化療是晚期NSCLC的主要治療方法。近半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，腫瘤藥物的發(fā)展均集中在細(xì)胞毒化療藥物上。雖然在蒽環(huán)類(lèi)（如阿霉素、表阿霉素）、鉑類(lèi)（如順鉑、卡鉑）之后又有很多強(qiáng)有力的藥物如紫杉醇、鹽酸伊立替康注射液等相繼問(wèn)世，但化療藥物單獨(dú)使用由于療效低、毒性大，所以并未對(duì)進(jìn)展期NSCLC 的治療及生存期帶來(lái)突破性進(jìn)展。至今對(duì)于NSCLC 的治療，仍主張應(yīng)用聯(lián)合化療，以達(dá)到增加療效、提高患者生存期的目的。含鉑方案目前仍是治療晚期NSCLC 的標(biāo)準(zhǔn)方案。以鉑類(lèi)藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療雖能改善晚期非小細(xì)胞肺癌患者的生存期、癥狀和生活質(zhì)量，但其療效已經(jīng)達(dá)到了平臺(tái)期[8]，提高療效關(guān)鍵在于推出高效低毒的新藥。中藥（有效提取成分[9]、單味藥[10]、復(fù)方成分[11]）誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為一條很有希望治療腫瘤的新途徑[12]。本研究結(jié)果表明，AMP-Na 25～100 μg/ml與系列質(zhì)量濃度的卡鉑合用后，對(duì)卡鉑抑制GLC-82細(xì)胞的增殖有協(xié)同作用。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，受多種機(jī)制調(diào)節(jié)和制約。流式細(xì)胞Annexin Ⅴ-PI 雙染色法利用Annexin Ⅴ能與凋亡細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸特異結(jié)合，PI 能特異透過(guò)死細(xì)胞膜使其染色的原理，可將凋亡早期、晚期細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)，是目前常用的細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法。本研究用Annexin Ⅴ-PI 雙染法檢測(cè)AMP-Na 單用及與卡鉑聯(lián)合作用GLC細(xì)胞48 h 后的細(xì)胞存活狀態(tài)，結(jié)果顯示25～100 μg/ml 的AMP-Na 作用于GLC-82 細(xì)胞48 h 后，處于凋亡和壞死狀態(tài)的細(xì)胞隨著AMP-Na 質(zhì)量濃度的增加而增多。卡鉑25 μg/ml 與AMP-Na 12.5～100 μg/ml聯(lián)合應(yīng)用后，凋亡和壞死狀態(tài)的細(xì)胞比AMP-Na單獨(dú)應(yīng)用時(shí)明顯增加。本研究結(jié)果表明，AMP-Na可以誘導(dǎo)GLC-82 細(xì)胞凋亡并產(chǎn)生細(xì)胞毒，進(jìn)而誘導(dǎo)GLC-82細(xì)胞凋亡，且對(duì)卡鉑的細(xì)胞增殖抑制起到協(xié)同作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖1 各組細(xì)胞凋亡和壞死變化（48 h）A.陰性對(duì)照組；B.卡鉑組；C.AMP-Na④組；D.AMP-Na③組；E.AMP-Na②組；F.AMP-Na①組；G.聯(lián)合用藥④組；H.聯(lián)合用藥③組；I.聯(lián)合用藥②組；J.聯(lián)合用藥①組Fig 1 The change of cell apoptosis and necrosis in each grou（p48 h）A.negative control group；B.carboplatin group；C.AMP-Na ④group；D.AMP-Na ③group；E.AMP-Na ②group；F.AMP-Na ①group；G.drug combination ④group；H.drug combination ③group；I.drug combination ②group；J.drug combination ①group

[1]張友勝，楊偉麗，熊皓平.顯齒蛇葡萄基本成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2001，13（5）：46.

[2]秦紅巖.高水溶性蛇葡萄素鈉鹽的制備及其抗腫瘤活性研究[D].蘭州：蘭州大學(xué)，2006.

[3]劉德育，丘明祺，梁婷韻.無(wú)刺根中蛇葡萄素的提取及其對(duì)黑色素瘤的抑制作用[J].中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，20（2）：127.

[4]劉德育，羅曼.血清藥理學(xué)方法研究蛇葡萄素抗B16黑色素瘤的作用[J].中藥材，2000，24（5）：348.

[5]朱孝峰，謝冰芬，劉宗潮，等.蛇葡萄素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及周期影響[J].中藥材，1999，30（增刊）：165.

[6]周寧寧，朱孝峰，謝冰芬，等.無(wú)刺根中蛇葡萄素體外抗菌素腫瘤作用研究[J].廣東藥學(xué)，2000，10（4）：7.

[7]曾颯，劉德育，葉燕麗，等.蛇葡萄素對(duì)人肺腺癌GLC-82裸鼠移植瘤的抑制作用[J].中藥材，2004，27（11）：842.

[8]張雪艷，陳玉蓉，王慧敏，等.紫杉醇聯(lián)合卡鉑治療晚期非小細(xì)胞肺癌臨床分析[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2007，12（2）：112.

[9]左云飛，魏巍，張耀錚，等.欖香烯誘導(dǎo)肝癌腹水瘤細(xì)胞系Hca-F25/CL-16A3凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥藥理與臨床，1998，9（2）：21.

[10]胡明昕，安超，李泉旺，等.中藥土貝母誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡的實(shí)時(shí)成像[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（7）：1 810.

[11]龔繼勇，劉利勝，魏玲，等.加味當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549 增殖的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（9）：1 941.

[12]馬慧萍，謝景文.中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2001，12（4）：242.