除濕丸的質量標準研究Δ

曾祖平，王 宏，錢 珊，彭 冰，韓旭陽，車曉平，何 薇#（.首都醫科大學附屬北京中醫醫院/北京市中醫研究所，北京 0000；.北京中醫藥大學東方學院中藥系009級，河北廊坊 06500；.首都醫科大學附屬北京中醫醫院，北京 0000）

除濕丸為皮外科泰斗趙炳南先生的臨床經驗方制成的水丸[1]，在首都醫科大學附屬北京中醫醫院臨床應用數十年，收載于《醫療單位制劑規程》中，為北京市醫療機構制劑法定制劑，在多家醫療機構使用。除濕丸由地黃、白鮮皮、黃芩、牡丹皮、茜草、紫草、茯苓皮、炒梔子、澤瀉、連翹、豬苓、當歸、威靈仙13 味藥組成，具有清熱涼血、燥濕止癢之功效，用于血熱濕熱所致的濕疹、脂溢性皮炎[2]。原質量標準只有一些試管反應作為鑒別內容，缺乏專屬性強的鑒別手段。為了保證臨床療效，控制制劑質量，本研究增加了牡丹皮、白鮮皮的顯微鑒別和當歸、茜草、梔子的薄層色譜（TLC）鑒別，并在同一色譜條件下測定了丹皮酚和黃芩苷的含量。按制定的質量標準檢測了兩家醫療機構的5 批樣品，結果表明該方法重現性好，簡便易行，可有效地控制本品質量。

1 材料

1.1 儀器

1100 系列高效液相色譜（HPLC）儀，包括二元泵、自動進樣器、多波長檢測器（美國Agilent公司）；DM2500M顯微鏡（德國Leica 公司）；YOKO-ZS 紫外線分析攝影儀（武漢藥科新技術開發公司）；XS205 DU專業型分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；SK7210HP型超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司，功率：350 W，頻率：59 kHz）；Milli-Q純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

除濕丸（首都醫科大學附屬北京中醫醫院，批號：120601、120602、120603；北京國濟中醫醫院，批號：110108、120120）；除濕丸處方飲片（北京杏林藥業有限責任公司，批號：地黃12052902、白鮮皮11110601、黃芩12010603、牡丹皮11090701、茜 草11101501、紫 草10121501、茯 苓 皮10112701、炒 梔 子11090802、澤瀉10092201、連翹11082303、豬苓10111602、當歸12022503、威靈仙11040901，規格：1 kg/袋）；當歸對照藥材（120927-200613）、茜草對照藥材（1049-9701）、梔子對照藥材（120986-201108）、丹 皮 酚（110708-200506）、黃 芩 苷（110715-201016）均購自中國食品藥品檢定研究院；硅膠G 薄層層析預制板（中國青島海洋化工集團）；乙腈為色譜純（美國Fisher 公司），水為純凈水（純水儀自制），甲醇、乙醚、乙醇、正己烷、乙酸乙酯、石油醚（60～90 ℃）、丙酮、甲酸均為分析純（北京化學試劑公司）。

2 方法與結果

2.1 鑒別

2.1.1 白鮮皮、牡丹皮的顯微鑒別[3-4]取本品適量，置顯微鏡下觀察：纖維單數散在，黃色，直徑25～100 μm，壁厚，層紋明顯，為白鮮皮，詳見圖1；草酸鈣簇晶存在于無色薄壁細胞中，有時數個排列成行，為牡丹皮，詳見圖2。

2.1.2 當歸的TLC鑒別[3，5]取本品10 g，研細，加乙醚30 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液揮干，殘渣加乙醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。取當歸藥材0.5 g，加乙醚20 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液揮干，殘渣用乙醇1 ml溶解作為當歸對照藥材溶液。按處方比例稱取除當歸以外的其他藥材飲片適量，粉碎，稱取10 g，照上述供試品溶液的制備方法制成缺當歸的陰性對照溶液。照薄層色譜法[2010 年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB]試驗，吸取供試品溶液、對照藥材溶液和缺當歸的陰性對照溶液各10 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（4 ∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾，詳見圖3。

圖1 白鮮皮顯微特征Fig 1 Microscopic characteristics of C.dictamni

圖2 牡丹皮顯微特征Fig 2 Microscopic characteristics of C.moutan

圖3 當歸的薄層色譜圖1、7.當歸對照藥材；2～4.3 批供試品（北京中醫醫院）；5～6.缺當歸的陰性對照；8～9.2批供試品（北京國濟中醫醫院）Fig 3 TLC of A.sinensis1、7.reference substance of A.sinensis；2-4.3 batches of test samples（Beijing Hospital of TCM）；5-6.negative control without of A.sinensis；8-9.2 batches of test samples（Beijing Guoji TCM Hospital）

2.1.3 茜草的TLC 鑒別[3]將“2.1.2”中乙醚提取后的殘渣揮盡溶劑，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1，V/V）混合溶液20 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。取茜草藥材0.5 g，加甲醇10 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至約1 ml，作為茜草對照藥材溶液。按處方配比稱取除茜草以外的其他藥材飲片適量，粉碎，稱取10 g，加乙醚30 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液棄去，藥渣按照供試品溶液的制備方法制成缺茜草的陰性對照液。按薄層色譜法[2010年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB]試驗，吸取“2.1.3”中供試品溶液、缺茜草的陰性對照溶液各10 μl和對照藥材溶液5 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-丙酮（4 ∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾，詳見圖4。

圖4 茜草的薄層色譜圖1、7.茜草對照藥材；2～4.3 批供試品（北京中醫醫院）；5～6.缺茜草的陰性對照；8～9.2批供試品（北京國濟中醫醫院）Fig 4 TLC of R.cordifolia1、7.reference substance of R.cordifolia；2-4.3 batches of test samples（Beijing Hospital of TCM）；5-6.negative control without of R.cordifolia；8-9.2 batches of test samples（Beijing Guoji TCM Hospital）

2.1.4 梔子的TLC鑒別[3，5]取本品10 g，研細，加乙醚30 ml，超聲處理10 min，濾過，濾渣揮盡溶劑，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1，V/V）混合溶液20 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1 ml 使溶解，作為供試品溶液。取梔子藥材1 g，加50%甲醇10 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液作為梔子對照藥材溶液。按處方配比稱取除梔子以外的其他藥材飲片，粉碎，稱取10 g，加乙醚30 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液棄去，藥渣按照“2.1.3”中供試品溶液的制備方法制成缺梔子的陰性對照溶液。按薄層色譜法[2010 年版《中國藥典》（一部）附錄ⅥB]試驗，吸取上述供試品溶液、缺梔子的陰性對照溶液各10 μl和對照藥材溶液5 μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（5 ∶5 ∶1 ∶1，V/V V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，熱風吹至斑點顯色清晰，置于日光下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾，詳見圖5。

圖5 梔子的薄層色譜圖1、7.梔子對照藥材；2～4.3 批供試品（北京中醫醫院）；5～6.缺梔子的陰性對照；8～9.2批供試品（北京國濟中醫醫院）Fig 5 TLC of G.fructus1、7.reference substabce of G.fructus；2-4.3 batches of test samples（Beijing Hospital of TCM）；5-6.negative control without of G.fructus；8-9.2 batches of test samples（Beijing Guoji TCM Hospital）

2.2 含量測定[3，6]

2.2.1 色譜條件和系統適用性試驗 色譜柱：Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水-磷酸（47 ∶53 ∶0.2，V/V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μl。理論板數按黃芩苷峰計算＞2 500，分離度＞1.5；按丹皮酚計算＞5 000，分離度＞1.5。

2.2.2 溶液的制備（1）對照品溶液。精密稱取已干燥（60 ℃減壓干燥4 h）的黃芩苷對照品0.003 69 g，以甲醇定容于25 ml量瓶中，制成每1 ml含0.147 6 mg的黃芩苷對照品溶液。精密稱取丹皮酚對照品0.006 64 g，以甲醇定容于25 ml量瓶中，制成每1 ml 含0.265 6 mg 的丹皮酚對照品溶液。（2）供試品溶液。取除濕丸粉末（50目）1 g，精密稱定，置于50 ml量瓶中，加入70%乙醇45 ml，超聲處理30 min，放至室溫，以70%乙醇定容，搖勻，取上清液，經微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 空白干擾試驗 按處方比例制備不含黃芩和牡丹皮的藥品，按照上述供試品溶液制備方法制備缺黃芩和牡丹皮的陰性對照溶液。取“2.2.2”項下對照品溶液、供試品溶液和上述缺黃芩和牡丹皮的陰性對照溶液各適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。結果顯示，在與黃芩苷和丹皮酚保留時間相應的位置上未見相關吸收峰，說明本品中其他成分對黃芩苷和丹皮酚的測定無干擾。色譜見圖6。

圖6 除濕丸的高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.缺黃芩、牡丹皮的陰性對照品；1.黃芩苷；2.丹皮酚Fig 6 HPLC chromatograms of Chushi pillA.control sample；B.test sample；C.negative control sample without of Scutellaria baicalensis and C.moutan；1.baicalin；2.paeonol

2.2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.2”項下兩種對照品溶液各2 ml，置于同一5 ml 量瓶中，以甲醇定容至刻度，制成黃芩苷（59.04 μg/ml）和丹皮酚（106.24 μg/ml）的混合對照品溶液。分別進樣1、2、4、8、12、16、20 μl，按“2.2.1”項下色譜條件測定，記錄黃芩苷和丹皮酚峰面積。分別以黃芩苷和丹皮酚峰面積積分值（y）為縱坐標，以進樣量為橫坐標（x，μg），進行線性回歸，得黃芩苷的回歸方程：y＝3 432x－5.280（r＝0.999 9），丹皮酚的回歸方程：y＝4 419x－18.67（r＝0.999 9）。結果表明，黃芩苷、丹皮酚的進樣量分別在0.059 04～1.180 8、0.106 24～2.124 8 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.4”項下混合對照品溶液10 μl，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣5 次，記錄黃芩苷和丹皮酚的峰面積。結果，黃芩苷、丹皮酚的RSD 分別為0.61%、0.87%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取同一供試品（批號：120120）溶液適量，每隔2 h左右進樣測定一次，連續測定14 h。結果，黃芩苷、丹皮酚峰面積的RSD 分別為0.74%、0.82%，表明供試品溶液在14 h內基本穩定。

2.2.7 重復性試驗 取同一批次除濕丸（批號：120120）適量，粉碎，過篩（50目），精密稱取6 份，每份約1 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算樣品含量。結果，除濕丸中黃芩苷平均含量為1.13 mg/g，RSD＝2.06%，丹皮酚平均含量為1.68 mg/g，RSD＝1.40%，表明本方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批（批號：120120，黃芩苷平均含量為1.13 mg/g，丹皮酚平均含量為1.68 mg/g）除濕丸粉末適量，并加入一定量的黃芩苷（0.644 4 mg/ml）和丹皮酚（1.185 6 mg/ml）混合對照品溶液，其余操作同“2.2.2”項下供試品溶液制備方法，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率，結果詳見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.2.9 樣品含量測定 取5批除濕丸樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算黃芩苷和丹皮酚的含量，結果詳見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3，mg/g）Tab 2 Content determination results of sample（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 定性鑒別

除濕丸為中藥復方制劑，由中藥細粉用水制成丸劑。定性鑒別時首先考慮了簡便快速的顯微鑒別，結果方中白鮮皮、牡丹皮的顯微特征明顯，其他藥味無干擾。TLC研究中，筆者曾經嘗試鑒別處方中其他藥味。結果，供試品與紫草、澤瀉對照藥材無明顯對應斑點，與地黃、威靈仙、茯苓皮、豬苓對照藥材有對應斑點，但陰性有干擾，故未納入標準。

3.2 含量測定

黃芩苷是黃芩的主要活性成分，具有抗炎和抗變態反應、抗微生物等藥理作用[7-10]；丹皮酚是牡丹皮中的主要活性成分，具有抗菌、抗變態反應及免疫作用[11]。這些藥理作用與除濕丸功效密切相關，也是除濕丸的藥效成分，因此有必要控制其含量。含量測定制備供試品時，曾對供試品提取溶劑[甲醇、70%乙醇、甲醇-乙酸乙酯（1∶3，V/V）]進行了篩選，最終確定70%乙醇為供試品溶液的提取溶劑。篩選溶劑用量時，考察了100、50、25 ml用量。結果，50 ml與100 ml的提取量相當，故確定以50 ml作為提取溶劑用量。

綜上所述，本方法操作簡便、結果準確、重現性好，可作為除濕丸的質量控制方法。

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