雙波長(zhǎng)HPLC法測(cè)定酸性龍膽合劑中龍膽苦苷和橙皮苷的含量Δ

王文月，劉志宏，黃愛(ài)文，宋洪濤#（.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院藥學(xué)科，福州 350025；2.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福州 35008）

酸性龍膽合劑臨床主要用于治療食欲不振及胃酸缺乏等癥。本品處方收載于《中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》（2002年版）中，在該標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定項(xiàng)中，僅有鹽酸的含量測(cè)定項(xiàng)，使得其制劑質(zhì)量難以控制。有研究分別對(duì)龍膽苦苷或橙皮苷進(jìn)行了單獨(dú)測(cè)定[1-4]，但單一指標(biāo)成分測(cè)定難以反映中藥質(zhì)量的整體特征。因此，本研究建立了雙波長(zhǎng)高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定龍膽苦苷、橙皮苷兩種成分含量的方法，以為進(jìn)一步控制該制劑的質(zhì)量水平提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀（美國(guó)Agilent公司）；SZ-97A型自動(dòng)三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

酸性龍膽合劑（自制，批號(hào)：20131030、20131106、20131113、20131120、20131127、20131204）；稀鹽酸（鄭州天耀科技有限公司，批號(hào)：130419，分析純）；橙皮酊（福州海王金象中藥制藥有限公司，批號(hào)：121205）；龍膽苦苷和橙皮苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：110770-201013、110721-201115，純度分別為：96.9%、95.3%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，25%→30%A；10～20 min，30%→40%A；20～23 min，40%A）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm（龍膽苦苷）、283 nm（橙皮苷）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。在此色譜條件下，龍膽苦苷和橙皮苷的色譜峰形良好，保留時(shí)間分別為6.757、19.910 min，兩種組分的理論板數(shù)分別以龍膽苦苷峰和橙皮苷峰計(jì)均＞3 000，分離度均＞2.0。色譜見(jiàn)圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密量取龍膽苦苷和橙皮苷對(duì)照品各適量，加甲醇制成每1 ml分別含龍膽苦苷和橙皮苷400、80 μg的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取本品2.5 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品（270 nm）；C.不含龍膽的陰性對(duì)照（270 nm）；D.供試品（283 nm）；E.不含陳皮陰性對(duì)照（283 nm）；1.龍膽苦苷；2.橙皮苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed substance control；B.test sample（270 nm）；C.negative control withoutR.Gentianae（270 nm）；D.test sample（283 nm）；E.negative control withoutC.reliculate（283 nm）；1.gentiopicroside；2.hesperidin

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按處方分別取各味藥材適量，按處方工藝分別制備不含龍膽和陳皮的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法分別制備陰性對(duì)照溶液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，經(jīng)0.45微孔濾膜濾過(guò)，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品的質(zhì)量濃度（c，μg/ml）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得龍膽苦苷的回歸方程為A＝10.037 3c－65.697 6（r＝0.999 7）、橙皮苷的回歸方程為A＝9.132 7c－5.688 5（r＝0.999 7）。結(jié)果表明，龍膽苦苷和橙皮苷的質(zhì)量濃度分別在20～200、4～40μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密量取混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，龍膽苦苷和橙皮苷的峰面積RSD分別為0.54%、1.16%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批號(hào)的樣品（批號(hào)：20131204）各適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，龍膽苦苷、橙皮苷的峰面積RSD分別為1.39%、1.32%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品制備的供試品溶液適量，分別于放置0、1、4、8、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，龍膽苦苷、橙皮苷的峰面積RSD分別為1.89%、1.46%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品適量，共9份，分別精密加入一定量的龍膽苦苷和橙皮苷對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，混勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.8 樣品含量測(cè)定

精密稱取6批酸性龍膽合劑樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算各指標(biāo)成分的質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝6，mg/ml）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝6，mg/ml）

3 討論

3.1 測(cè)定指標(biāo)的選擇

酸性龍膽合劑是由龍膽、陳皮和豆蔻3味中藥材加工制成的制劑。龍膽的主要成分包括裂環(huán)環(huán)烯醚萜及其苷類、生物堿、三萜類、黃酮類等化合物。其中，裂環(huán)環(huán)烯醚萜為龍膽的主要活性部位，包括龍膽苦苷、獐牙菜苦苷和當(dāng)藥苷等，龍膽苦苷為其指標(biāo)性成分，故選其為含量測(cè)定指標(biāo)[5]。陳皮主要含揮發(fā)油及橙皮苷為主的黃酮類成分等，故選擇橙皮苷為其含量測(cè)定指標(biāo)[6]。豆蔻又稱白豆蔻，其中含有的大量揮發(fā)油是其重要的藥效成分，由于揮發(fā)油的含量測(cè)定采用的是氣相色譜法，故本研究未將其進(jìn)行同時(shí)測(cè)定。

3.2 流動(dòng)相的選擇

龍膽苦苷的含量測(cè)定方法收載于2010年版《中國(guó)藥典》（一部）中，以十八烷基硅烷鍵合膠柱為填充劑，以甲醇-水（25∶75，V/V）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm[7]。《中國(guó)藥典》中橙皮苷的含量測(cè)定方法中流動(dòng)相為甲醇-醋酸-水（35∶4∶61，V/V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm[7]。因龍膽苦苷和橙皮苷的流動(dòng)相皆為甲醇-水，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[1-4]，試驗(yàn)時(shí)以甲醇-水為流動(dòng)相系統(tǒng)，并加入醋酸和磷酸作改性劑時(shí)，各峰峰形較好，分離度較高。

3.3 含量限度的確定

本研究結(jié)果表明，合劑中龍膽苦苷的質(zhì)量濃度為0.330～0.339 mg/ml，橙皮苷質(zhì)量濃度為0.069～0.076 mg/ml。2010年版《中國(guó)藥典》（一部）中龍膽藥材規(guī)定龍膽苦苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于3.0%，陳皮藥材規(guī)定橙皮苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得低于3.5%。按處方量折算，酸性龍膽合劑中龍膽苦苷質(zhì)量濃度理論值為0.6 mg/ml，橙皮苷質(zhì)量濃度理論值為0.63 mg/ml。考慮到藥材不同及滲濾工藝的提取率較低，根據(jù)6批樣品的質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果，取平均值的一半，規(guī)定合劑龍膽苦苷質(zhì)量濃度每1 ml不得少于0.017 mg，橙皮苷質(zhì)量濃度每1 ml不得少于0.036 mg。

綜上所述，本研究可為擬訂《中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》中酸性龍膽合劑的含量測(cè)定提供可靠依據(jù)。

[1]楊慧玲，司慶文，侯勤正，等.HPLC法測(cè)定不同海拔長(zhǎng)柄秦艽中龍膽苦苷、馬錢酸、獐牙菜苦苷和獐牙菜苷[J].中草藥，2010，41（10）：1 720.

[2]許秋霞，李小芳，舒予，等.干燥方法對(duì)龍膽炮制品中龍膽苦苷含量的影響[J].中國(guó)藥房，2013，24（7）：622.

[3]汪金玉，帥歐，林勵(lì)，等.橘葉黃酮類成分的研究與薄層色譜鑒別[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28（2）：191.

[4]馬秋菊，孫萍.消脂通脈顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國(guó)藥房，2013，24（35）：3 325.

[5]楊維霞.秦嶺龍膽的化學(xué)成分研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2004.

[6]王元清，嚴(yán)建業(yè)，師白梅，等.不同批次枳殼中柚皮苷、新橙皮苷、總黃酮、揮發(fā)油的含量比較及質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（7）：146.

[7]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2010版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：89-176.