HPLC法測定復方玄駒膠囊中淫羊藿苷的含量

楊炳川，楊浩然，方應權，周 勇，龍 明，冉 宏（重慶三峽醫藥高等專科學校附屬醫院，重慶 404000）

復方玄駒膠囊由黑螞蟻、淫羊藿、枸杞子、蛇床子等4種中藥組成，具有溫腎、壯陽、益精之功效，臨床常用于治療腎陽虛型患者，癥見神疲乏力、精神不振、腰膝酸軟、少腹陰器發涼、精冷滑泄、肢冷尿頻、性欲低下、功能性勃起功能障礙等[1-2]。其中，淫羊藿為方中君藥，而淫羊藿苷為淫羊藿的主要活性成分。為進一步控制復方玄駒膠囊的質量，本研究建立了高效液相色譜（HPLC）法測定該藥中淫羊藿苷含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包含二極管陣列檢測器（日本島津公司）；旋轉蒸發儀（金壇市華歐實驗儀器廠）；減壓干燥箱（江蘇南京海汪制藥機械裝備有限公司）；分析天平（上海市天平儀器廠）；超聲波清洗器（上海市聲波儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

復方玄駒膠囊（施強藥業集團，批號：141001、141002、141003）；淫羊藿苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110737-200415）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Cosmosil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（55∶45，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：270 nm；進樣量：20 μl。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.淫羊藿苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.icariin

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密取淫羊藿苷對照品8 mg，置于50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密吸取2 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為32 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取復方玄駒膠囊內容物適量，研細，精密稱取0.3 g，置于具塞錐形瓶中，加乙醇適量，稱定質量，置水浴上加熱回流提取30 min，放冷，再次精密稱定，用乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過；精密量取續濾液10 ml，蒸干溶劑，殘渣加水使溶解，并轉移至分液漏斗中，用乙醚振搖提取3次，每次20 ml，棄去乙醚液，水層用醋酸乙酯-水飽和的正丁醇（2∶1，V/V）的混合溶液振搖提取5次；合并提取液，蒸干溶劑，殘渣加甲醇使溶解，并轉移至50 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 線性關系考察

取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇分別制成每1 ml含淫羊藿苷49.95、99.90、199.80、299.70、399.60、499.50 μg的對照品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以對照品的質量濃度（x，mg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y＝54 928x+40 162（r＝0.999 7）。結果表明，淫羊藿苷的質量濃度在49.95～499.50 μg/ml范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.4 精密度試驗

精密量取對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，RSD＝0.06%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

精密吸取對照品溶液適量，分別于配制0、2、4、6、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，RSD＝1.6%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.6 重復性試驗

取同一批樣品約1 g，共6份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算樣品含量。結果，RSD＝1.8%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一批樣品各適量，共6份，分別精密加入淫羊藿苷對照品溶液各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.8 樣品含量測定

取3批次（批號：141001、141002、141003）的樣品各1.0 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果，3批樣品的含量分別為4.058、5.161、4.350 mg/g，平均含量為4.523 mg/g。

3 討論

目前，文獻報道中關于淫羊藿苷的含量檢測方法有紫外分光光度法、導數光譜法、室溫燐光法、薄層掃描法、高效液相色譜法、毛細管膠束電動色譜法等[3]，但最為常見的為HPLC法。淫羊藿苷具有可溶解于乙醇、乙酸乙酯的性質。在實驗中，筆者曾嘗試使用30%、50%、70%的乙醇分別回流提取2次、3次、4次，并進行含量比較。結果顯示，70%的乙醇提取效率最高，且醇提3次和4次的淫羊藿苷含量明顯較醇提2次高，但醇提3次和4次之間淫羊藿苷含量無明顯差異，因此選擇70%乙醇回流醇提3次的工藝。

經全波長掃描，淫羊藿苷在270 nm波長處吸收較大，結果與2010版《中國藥典》記載一致。因此，確定淫羊藿苷的檢測波長為270 nm。在流動相的選擇上，有文獻報道乙腈-水有拖尾影響[4-5]，筆者嘗試使用甲醇-水、甲醇-0.1%冰醋酸、乙腈-3.8%冰醋酸（28∶72，V/V）、甲醇-磷酸水溶液（55∶45，V/V）為流動相進行試驗。結果發現，甲醇-磷酸水溶液（55∶45，V/V）出峰良好，且分離度高，陰性樣品對測定無干擾，淫羊藿苷的保留時間約為9 min，保留時間、分離度及淫羊藿苷理論板數均符合要求。

綜上所述，本研究建立的含量測定方法簡單易行、結果準確、重復性好，可用于復方玄駒膠囊的質量控制。

[1]張訊，梁季鴻，梁世坤，等.復方玄駒膠囊聯合他莫昔芬治療特發性少精子癥的臨床研究[J].中華男科學雜志，2012，18（7）：661.

[2]王欣，蘇晶石，楊可為，等.復方玄駒膠囊治療前列腺炎的療效觀察[J].中華醫院感染學雜志，2011，21（10）：2 045.

[3]尹志峰，劉敬閃，張蘭桐.淫羊藿苷的含量測定方法[J].中國醫院藥學雜志，2003，23（8）：47.

[4]崔曉紅，袁志芳，張蘭桐.益腎強身片中淫羊藿苷的含量測定[J].中國新藥雜志，2005，14（11）：78.

[5]凌云.HPLC法測定不同批號復方玄駒膠囊中淫羊藿苷的含量[J].亞太傳統醫藥，2014，10（19）：23.