HPLC法測定二氮嗪注射液的含量

劉玉含，張連成，王超眾，賈首時（1.齊齊哈爾市第一醫院，黑龍江齊齊哈爾 161005；.齊齊哈爾市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江齊齊哈爾 161006）

二氮嗪注射液在臨床常用于治療高血壓危象、高血壓腦病、幼兒特發性低血糖、胰島細胞瘤引起的嚴重低血糖病、痛經和流產等癥[1]，但對嗜鉻細胞瘤或單胺氧化酶抑制劑引起的高血壓無效[2]。二氮嗪注射液收載于《國家藥品標準》（第3冊）[3]，采用紫外分光光度（UV）法測定其含量，方法操作簡便，但專屬性較差，含量結果易受溶劑和輔料的干擾。為此，筆者參考相關文獻[4]，以氫氯噻嗪為內標物，建立了采用高效液相色譜（HPLC）法測定二氮嗪注射液含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

Waters 2695e型HPLC儀，包括2489紫外-可見光檢測器和Empower工作站（美國Waters公司）；SK2510HLC型超聲波清洗機（上海科導超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：50 kHz）；BP221S電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

二氮嗪注射液（北京雙鶴現代醫藥技術有限責任公司，批號：131002、130907、130418，規格：20 ml∶0.3 g；北京紫竹藥業有限公司，批號：130317、130712、130509，規格：20 ml∶0.3 g）；二氮嗪對照品（上海博頓生物化工有限公司，批號：100203-201301，純度：99.95%）；氫氯噻嗪內標物（中國食品藥品檢定研究院，批號：100309-201103）；甲醇為色譜純，庚烷磺酸鈉為色譜級，醋酸為優級純，水為二次蒸餾的純化水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 氫氯噻嗪內標溶液 精密稱取氫氯噻嗪內標物15 mg，置于50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液 精密量取本品2 ml，置于100 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 ml，加入“2.2.1”項下氫氯噻嗪內標溶液5 ml，置于50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 對照品溶液 精密稱取二氮嗪對照品15 mg，置于50 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 ml，加入“2.2.1”項下氫氯噻嗪內標溶液5 ml，置于50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 空白輔料溶液 取按二氮嗪處方中不含二氮嗪的輔料適量制成溶液，按“2.1.2”項下方法制備，即得。

2.2 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Waters symmetry-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.01 mol/L庚烷磺酸鈉-甲醇-醋酸（79∶20∶1，V/V/V）；檢測波長：254 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。分別取“2.1”項下對照品溶液、供試品溶液、空白輔料溶液各20 μl，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。理論板數以二氮嗪峰計為4 500，分離度＞1.5。色譜見圖1。

2.3 線性關系考察

圖1 高效液相色譜法圖A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.空白輔料溶液；1.氫氯噻嗪內標物；2.二氮嗪Fig 1 HPLC ChromatogramsA.reference solution；B.test solution；C.blank solution；1.diazoxi-de；2.Internal standard of hydrochlorothiazide

精密量取二氮嗪對照品適量，加流動相制成質量濃度為1.5 mg/ml的溶液，分別精密吸取上述溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml，置于10 ml量瓶中，再分別精密加入“2.1.1”項下氫氯噻嗪內標溶液0.5 ml，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含二氮嗪質量濃度為0.030、0.060、0.090、0.120、0.150 mg/ml及含氫氯噻嗪內標溶液質量濃度為0.5 mg/ml的溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣20 μl，記錄峰面積。以質量濃度（x，mg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程y＝47.76x+0.085 3（r＝0.999 8）。結果表明，二氮嗪的質量濃度在0.030～0.110 mg/ml范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.4 精密度試驗

精密量取“2.1.3”項下對照品溶液20 μl，按“2.2”項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積。結果，RSD＝0.68%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取樣品（批號：131002）適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫與冷藏4 ℃條件下放置0、2、4、8、10、12 h時進樣，記錄峰面積。結果，二氮嗪在室溫放置12 h的RSD為0.95%（n＝6），冷藏4 ℃放置12 h的RSD為0.79%（n＝6），表明供試品溶液在室溫與冷藏4 ℃條件下12 h內穩定性均較好。

2.6 重復性試驗

取樣品（批號：131002）2 ml（約相當于二氮嗪30 mg），共6份，分別置于100 ml量瓶中，加甲醇適量并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 ml，分別置于50 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，RSD＝0.68%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的同一批樣品（批號：131002）適量，共9份，分別精密加入低、中、高3種質量濃度的二氮嗪對照品各適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結果見表1。

2.8 樣品含量測定

取6批樣品各適量，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，以內標法計算含量結果，并與筆者在試驗前期采用UV法測定的結果進行比較。結果發現，UV法測定的結果高于HPLC法，表明HPLC法測定時可排除輔料等因素的干擾，方法更為準確，詳見表2。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝3）Tab 1 Results of recovery test（n＝3）

表2 樣品含量測定結果（%，n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（%，n＝3）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

筆者將二氮嗪用流動相溶解制成每1 ml含90 μg的溶液，在200～400 nm范圍內進行掃描[4]。結果發現，二氮嗪在254 nm波長處有最大吸收，故將檢測波長確定為254 nm。

3.2 流動相的選擇

筆者比較了多種流動相系統（甲醇-磷酸鹽緩沖液、乙腈-磷酸鹽緩沖液、甲醇-水）對結果的影響，同時考慮到二氮嗪和氫氯噻嗪內標物均具有弱堿性，因此采用離子對試劑庚烷磺酸鈉加入流動相進行試驗。當選擇0.01 mol/L庚烷磺酸鈉溶液-甲醇-醋酸（79∶20∶1，V/V/V）為流動相時，二氮嗪和氫氯噻嗪峰形尖銳對稱，且出峰時間短。

國家藥品標準采用UV法測定了二氮嗪的含量，該方法易受到輔料等因素的影響，測定的結果不能真實地反映二氮嗪的含量。而HPLC法專屬性強，加入內標物質后可以校準和消除由于操作條件的波動而對分析結果產生的影響，可提高分析結果的準確度，更適用于二氮嗪的含量測定。

綜上所述，本方法簡便、準確，專屬性好，精密度高，可用于二氮嗪注射液的質量控制。

[1]何柯，胡蘊，劉好，等.二氮嗪與糖尿病[J].臨床薈萃，2014，29（2）：220.

[2]李少民，成少利，萬俊哲，等.二氮嗪防治低氧性肺動脈高壓的作用機制[J].西安交通大學學報，2007，28（5）：28.

[3]國家藥典委員會.國家藥品標準：新藥轉正標準：第3冊[S].北京：化學工業出版社，2002：11.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄ⅤD、附錄ⅣA.