HPLC法測定陜西產黃花油點草中煙花苷的含量Δ

孫 靜，何曉娟，劉潔瓊（.陜西中醫學院藥學院，陜西咸陽 7046；.天津紅日藥業股份有限公司，天津

301700）

黃花油點草來源于百合科Liliaceae植物黃花油點草Tricyrtis maculate的干燥全草，具有安神除煩、活血消腫之功效，是陜西省民間用于跌打損傷的重要習用品種之一。該藥材在陜西蘊藏量較高、用藥歷史悠久、療效突出，但目前尚缺乏相應的質量評價依據。本課題組在前期基礎研究過程中，通過提取分離純化研究得到了該藥材的總黃酮部位，并發現該部位具有較強的活血作用，且煙花苷為其主要活性成分之一。本試驗擬通過對黃花油點草的水提取物和總黃酮部位中煙花苷的含量進行測定，以期為該藥材質量標準的建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

L-2400型高效液相色譜（HPLC）儀（日本日立公司）；AR-1140型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度：0.1 mg）。

1.2 試藥

黃花油點草總黃酮部位[1-2]（實驗室自制）；煙花苷對照品（BioBioPHa Co.，Ltd.，批號：BBP00732，純度：98.8%）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～30 min，15%→25%A；30～80 min，25%→55%A）；流速：1 ml/min；柱溫：20 ℃；檢測波長：360 nm。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.煙花苷對照品；B.黃花油點草藥材；C.總黃酮提取物Fig 1 HPLC chromatogramsA.nicotiflorin control；B.T.maculate；C.total flavonoid extract

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取煙花苷對照品1.96 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得質量濃度為0.196 mg/ml的對照品貯備液。精密移取0.1 ml對照品貯備液，置于10 ml量瓶中，加甲醇定容，經0.45μm微孔濾膜濾過，即得質量濃度為1.960 μg/ml的對照品溶液。

2.2.2 總黃酮供試品溶液 精密稱取黃花油點草總黃酮[1]部位1 g，用甲醇定容至10 ml量瓶中，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 藥材供試品溶液 精密稱取同一批黃花油點草藥材5.200 3 g，按照提取工藝[2]提取；提取液濃縮干燥后，加甲醇溶液，濾過，并定容至50 ml量瓶中，經0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 線性關系考察

分別精密吸取對照品溶液3、6、9、12、15、18 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以對照品的進樣量（x，μg）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝4.7×103x+9 197.3（r＝0.999 5）。結果表明，煙花苷的進樣量在5.9～35.3 μg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.4 精密度試驗

精密吸取質量濃度為1.9 μg/ml的煙花苷對照品溶液10 μl，按“2.1”項下色譜條件連續進樣5次，記錄峰面積。結果，RSD＝0.49%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取總黃酮部位及藥材供試品溶液各適量，在室溫下放置0、2、4、6、9、12 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，藥材和有效部位中煙花苷峰面積的RSD分別為1.79%、1.98%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.6 重復性試驗

分別取總黃酮部位及黃花油點草藥材各適量，按“2.2.2”及“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，各6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結果，藥材中煙花苷的質量分數分別為0.727%、0.733%、0.728%、0.739%、0.715%、0.720%，總黃酮部位中煙花苷的質量分數分別為1.042%、1.036%、1.048%、1.015%、1.057%、1.023%，其RSD分別為1.19%，1.51%（n＝5），表明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取同一批藥材約5 g，共6份，分別精密加入質量濃度為15 μg/ml的煙花苷對照品溶液1 ml，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.8 樣品含量測定

精密稱取總黃酮部位和藥材各適量，按“2.2.2”及“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量，結果見表2。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

取對照品溶液適量，在200～400 nm范圍進行三維掃描，結果對照品溶液在360 nm下有最大吸收，且基線平穩，故最終選擇360 nm波長作為檢測波長。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3.2 液相儀器與色譜柱的選擇

選用Thermo Hypersil GOLD色譜柱分別在Waters2695-2966型和日立L-2400型HPLC儀上以甲醇-0.4%磷酸水（30∶70，V/V）為流動相，對藥材供試品溶液進樣測定。根據出峰數與峰分離度情況選用儀器[3-5]，并對該儀器下的Thermo Hypersil GOLD、Thermo Hypersil GOLD aQ、Thermo BDS HYPERSIL C18等3種型號的色譜柱在同一條件下進行篩選。結果顯示，日立雙泵及Thermo Hypersil GOLD分離效果優于其他儀器及色譜柱，故選用此液相儀器及色譜柱進行煙花苷含量測定的研究。

3.3 流動相的選擇

分別以甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液系統在等度條件下測定煙花苷，根據出峰數目與峰分離度情況，初步確定選擇乙腈-磷酸水溶液系統為流動相系統[6-9]；并在此基礎上對該系統的梯度洗脫條件進行了進一步研究，根據出峰個數、峰形及峰分離度進行判斷，最終確定了“2.1”項下的流動相系統，其色譜峰分離效果最好、出峰信息較多。

綜上所述，本方法穩定、可行，可用于陜西產黃花油點草水提取物、總黃酮部位中煙花苷的含量測定。

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