蘄艾的HPLC指紋圖譜研究

盧 化，張義生，黎 強(qiáng)，楊小金，盧金清#（.武漢市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，武漢 43004；.湖北中醫(yī)藥大學(xué)/湖北省藥用植物研發(fā)中心，武漢 430065）

艾葉為菊科植物艾Artemisia argyi的干燥葉，具有散寒止痛、溫經(jīng)止血的作用[1]。艾葉在全國各地均有分布，其中以湖北蘄春者品質(zhì)最好，謂之蘄艾，譽(yù)為道地藥材。蘄艾Artemisia argyi Levl.et Van.var.argyi cv.Qiai為湖北省蘄春四寶之一，屬于我國國家地理標(biāo)志產(chǎn)品，其莖、葉均可入藥?！侗静菥V目》中記載：“近代惟湯陽者謂之北艾，四明者謂之海艾，自成化以來，則以蘄州（蘄春舊稱）者為勝，用充方物，天下重之，謂之蘄艾。”現(xiàn)代研究表明，蘄艾具有抗炎、抗過敏、鎮(zhèn)痛、抗肝纖維化、抗疲勞、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、抗氧化等多種藥理活性[2-8]。有學(xué)者利用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法同時(shí)測定艾葉及其炮制品中棕矢車菊素和異澤蘭黃素的含量[9]。但蘄艾的藥效成分復(fù)雜，僅靠單一指標(biāo)不能有效控制蘄艾質(zhì)量。指紋圖譜對(duì)于中藥及其制劑可提供豐富的鑒別信息，能夠全面反映中藥多組分復(fù)雜體系，其宏觀、可量化的鑒別手段能綜合反映和有效控制中藥的質(zhì)量，已成為國際公認(rèn)的中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制的有效手段。中藥指紋圖譜法從中藥材到中成藥的生產(chǎn)過程中，每一步都有明確的控制指標(biāo)，而指紋圖譜就是將這些指標(biāo)圖形化、信息化[10]。目前尚未有關(guān)于蘄艾指紋圖譜的相關(guān)研究。為了從整體上有效地評(píng)價(jià)和控制其質(zhì)量，本試驗(yàn)采用HPLC法對(duì)蘄艾指紋圖譜進(jìn)行了初步的研究，以期為完善蘄艾的品質(zhì)評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

DIONEX-ULTIMATE 3000型HPLC儀（美國戴安公司）；CP225D型電子分析天平（德國賽多利斯公司，精度：0.01 mg）；UP5200H型超聲波清洗器（熊貓集團(tuán)南京電子計(jì)量有限公司）。

1.2 試劑

柚皮苷、綠原酸、山柰酚對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：110722-201111、110753-201314、110861-00405）；乙腈為色譜純（美國天地公司），其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

10批蘄艾均于2011年5月采自湖北省蘄春縣，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室鑒定為菊科植物艾A.argyi的干燥葉。10批蘄艾藥材來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（梯度洗脫程序見表2）；流速：0.8 ml/min；柱溫：30 Ⅺ；檢測波長：330 nm。色譜見圖1。

表1 10批蘄艾藥材來源Tab 1 Origins of 10 batches ofA.argyi

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedures

圖1 高效液相色譜圖A.供試品；B.柚皮苷對(duì)照品；C.山柰酚對(duì)照品；D.綠原酸對(duì)照品；E.混合對(duì)照品溶液；F.陰性對(duì)照；1.綠原酸；2.柚皮苷；3.山柰酚Fig 1 HPLC chromatogramsA.test sample ；B.naringin control；C.kaempferol control；D.chlorogenic acid control；E.mixed control；F.negative control；1.chlorogenic acid；2.naringin；3.kaempferol

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱取柚皮苷、綠原酸、山柰酚對(duì)照品各適量，分別加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為1.00、0.12、0.15 mg/ml的柚皮苷、綠原酸、山柰酚對(duì)照品溶液，即得。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取柚皮苷、綠原酸、山柰酚對(duì)照品各適量，混勻，置同一量瓶中，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為1.29、0.05、0.09 mg/ml的柚皮苷、綠原酸、山柰酚的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液 取蘄艾藥材樣品約3 g，粉碎，精密稱定，精密加入80%甲醇溶液100 ml，靜置24 h，超聲萃取1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一批次蘄艾藥材樣品適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。結(jié)果，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD值均＜2%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次蘄艾樣品適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于制備0、2、4、8、16、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD值均＜2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次蘄艾樣品適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積的RSD值均＜2%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 指紋圖譜的測定與特征峰的確定 分別精密吸取10批樣品溶液各2 μl，注入色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，共標(biāo)定12個(gè)共有峰作為蘄艾藥材的指紋圖譜特征峰，并選擇6號(hào)峰（柚皮苷峰）作為參照峰。蘄艾的指紋圖譜見圖2；10批次蘄艾樣品的HPLC指紋圖譜見圖3。

圖2 蘄艾的指紋圖譜3.綠原酸；6.柚皮苷；10.山柰酚Fig 2 fingerprint ofA.argyi3.chlorogenic acid；6.naring in；10.kaemplferol

圖3 10批次蘄艾樣品的HPLC指紋圖譜Fig 3 HPLC fingerprint of 10 batches ofA.argyi samples

2.4.2 相似度評(píng)價(jià) 將所得的圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004版），經(jīng)過色譜峰匹配，進(jìn)行色譜峰差異性評(píng)價(jià)和整體相似性評(píng)價(jià)；通過該評(píng)價(jià)系統(tǒng)得出蘄艾的HPLC指紋圖譜共有模式，經(jīng)過與共有模式比較，10批蘄艾共有峰的相對(duì)保留時(shí)間以及相對(duì)峰面積的差別均較小，詳見表3、表4。10批蘄艾藥材的相似度均＞0.90，表明所建立的指紋圖譜技術(shù)指標(biāo)穩(wěn)定、重復(fù)性好，10批蘄艾藥材的主成分基本相同，詳見表5。

表3 10批次蘄艾樣品指紋圖譜各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 3 Relative retention time of 10 batches ofA.argyi samples fingerprint peaks

表4 10批次蘄艾樣品指紋圖譜各共有峰的相對(duì)峰面積Tab 4 Relative retention area of 10 batches ofA.argyi samples fingerprint peaks

表5 10批次蘄艾樣品相似度測定結(jié)果Tab 5 Similarity measurement results of 10 batches ofA.argyi samples

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

分別取柚皮苷、山柰酚、綠原酸對(duì)照品溶液及供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，采用二極管陣列檢測器（DAD）在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描分析。結(jié)果顯示，在330 nm處對(duì)照品溶液與供試品溶液均有最大吸收，檢測靈敏度高，因此最終確定以330 nm為檢測波長。

3.2 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)前期曾以甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相進(jìn)行等度和梯度洗脫考察，但色譜峰分離效果較差。在不斷嘗試色譜條件后，最終選用乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脫，在該色譜條件下，色譜圖分離效果較為理想。

3.3 提取方法的選擇

本試驗(yàn)分別采用加熱回流提取法、超聲提取法對(duì)蘄艾進(jìn)行制樣。結(jié)果表明，加熱回流提取和超聲提取的結(jié)果差異不大，但超聲提取操作簡便、快捷，因此采用超聲提取法作為供試品溶液的制備方法。

本研究首次采用HPLC法對(duì)蘄艾的指紋圖譜進(jìn)行了初步研究，試驗(yàn)結(jié)果表明各批次樣品之間相似度較高，樣品之間相關(guān)性良好，符合中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)的基本要求。本研究初步建立了蘄艾的HPLC指紋圖譜，方法學(xué)考察結(jié)果表明該方法穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性好，可為蘄艾的品質(zhì)評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

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