鹽酸頭孢他美酯干混懸劑微生物限度檢查方法的建立

甘永琦，朱 斌（廣西食品藥品檢驗所，南寧 530021）

鹽酸頭孢他美酯是第三代口服廣譜頭孢菌素類抗生素。其通過抑制細菌細胞壁合成過程中黏肽鏈的交叉連結，使細菌不能形成完整的細胞壁，從而發揮抗菌作用，且其活性不受細菌產生的β-內酰胺酶的影響。其對鏈球菌屬、肺炎鏈球菌等革蘭陽性菌及大腸埃希菌、流感嗜血桿菌、克雷伯菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、淋病奈瑟氏球菌等革蘭陰性菌都有很強的抗菌活性，尤其對第一、二代頭孢菌素敏感性低的沙雷菌屬、吲哚陽性變形桿菌、腸桿菌屬及檸檬酸菌屬的抗菌活性較為顯著，但其對假單胞菌、支原體、衣原體、腸球菌等耐藥性微生物無效[1-5]。自1992年上市以來，鹽酸頭孢他美酯得到了廣泛地應用，目前國內生產的劑型有干混懸劑、膠囊和片劑3種。2010年版《中國藥典》（二部）規定干混懸劑需進行微生物限度檢查。為此，筆者根據2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅪJ“微生物限度檢查法”口服制劑的規定，對鹽酸頭孢他美酯干混懸劑的微生物限度檢查方法進行研究和敏感菌株驗證，并用建立的方法對該品種進行細菌、霉菌及酵母菌計數和控制菌檢查，以分析其微生物污染狀況。

1 材料

1.1 儀器

WGP-500型電熱恒溫培養箱（上海安亭科學儀器廠）；LRH-250A型生化培養箱（廣東省醫療器械廠）；生物安全柜（新加坡ESCO公司）；MSL3768型高壓滅菌鍋（日本三洋公司）等。

1.2 藥品與試劑

鹽酸頭孢他美酯干混懸劑（浙江普洛康裕制藥有限公司，批號：130603、120104、120604、120601、130502、120802、130502、130403；浙江震元制藥有限公司，批號：20130103、20121102、20130102、20130102、20130103、20130501、20130503、20120409、20121002、20130502、20121003）；pH為7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京三藥科技開發公司，批號：120331）；氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號：10019318）。

1.3 菌種

大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽胞桿 菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（B）98001]、黑 曲 霉[CMCC（F）98003]均由中國醫學微生物菌種保藏管理中心提供。

1.4 培養基

營養瓊脂培養基（批號：110105）、改良馬丁培養基（批號：1202022）、玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號：1204102）、營養肉湯培養基（批號：130311）、膽鹽乳糖培養基（BL，批號：121127）等均購自北京三藥科技開發公司；4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基（MUG，批號：1304172）和靛基質（批號：130305）均購自北京陸橋技術部有限責任公司。

2 方法與結果

2.1 細菌、霉菌和酵母菌計數方法的建立及驗證

2.1.1 菌液的制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽胞桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基或營養瓊脂培養基中，33 ℃下培養18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基或改良馬丁瓊脂培養基中，25 ℃下培養24～28 h。上述培養物以0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數為50～100 CFU的菌懸液（菌懸液制備后應在2 h內使用，保存在2～8 ℃的菌懸液可在24 h內使用）。

2.1.2 供試液的制備 取本品10 g，加pH為7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，用勻漿儀以1 000 r/min勻漿30 s，混勻，靜置5～10 min，取上清液作為供試液。

2.1.3 回收率試驗（1）試驗組：取供試液1 ml，另分別取各試驗菌50～100 CFU，分別注入同一平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置于規定溫度下，細菌培養3 d，白色念珠菌和黑曲霉培養5 d，分別平行制備2個平皿，平板計數。（2）菌液組：取試驗菌50～100 CFU注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置于規定溫度下，細菌培養3 d，白色念珠菌和黑曲霉培養5 d，分別平行制備2個平皿，測定所加入的試驗菌數。（3）供試品對照組：取供試液1 ml注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置于37 ℃培養24～48 h，測定供試品的本底菌數。

對照組各試驗菌的回收菌應不低于70%?；厥章剩剑ㄔ囼灲M平均菌落數－供試品對照組平均菌落數）/菌液組的平均菌落數×100%。

2.1.4 細菌計數方法預試驗 根據文獻報道[6]，選取大腸埃希菌作為敏感菌株，分別采用常規法和薄膜過濾法（沖洗量為100 ml）對2個廠家各1批樣品進行方法篩選，結果見表1。

表1 大腸埃希氏菌驗證試驗結果（CFU/平皿）Tab 1 Verification results ofEscherichia coli（CFU/plate）

由表1可見，采用常規法試驗，2個廠家生產的鹽酸頭孢他美酯的大腸埃希菌回收率均未達到70%，不能有效消除鹽酸頭孢他美酯對細菌的抑制作用，因此采用常規法進行細菌計數不可行；而采用薄膜過濾法試驗結果顯示，沖洗量為100 ml時，大腸埃希菌的回收率＞70%，符合要求，因此初步確定采用沖洗量為100 ml的薄膜過濾法進行細菌計數。

2.1.5 計數方法的驗證 分別對3批樣品進行計數方法驗證，細菌采用薄膜過濾法，用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗100 ml，其他菌種采用常規法進行加菌回收率試驗，結果見表2。

表2 計數方法驗證試驗回收率結果（%）Tab 2 Recovery results of count verification test

由表2可見，5種規定試驗菌的回收率均＞70%，符合2010年版《中國藥典》（二部）的規定，方法成立。

2.2 控制菌檢查方法的建立與驗證

2.2.1 菌液的制備 接種大腸埃希菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，培養18～24 h，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數為10～100 CFU的菌懸液（菌懸液在室溫下放置應在2 h內使用，若保存在2～8 ℃可在24 h內使用）。

2.2.2 控制菌檢查方法（1）培養基稀釋法：供試品對照組取“2.1.2”項下的供試液10 ml，陽性對照組取供試液10 ml及大腸埃希菌10～100 CFU，陰性對照組取10 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液，均接種至500 ml的BL培養基中，培養18～24 h。（2）薄膜過濾法：取上述培養基稀釋法中各組的試液加入濾膜中，用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗100 ml，取出膜接種至100 ml的BL培養基中，培養18～24 h。

取上述培養物0.2 ml，接種至含5 ml MUG培養基的試管內培養，分別于培養5、24 h時置紫外光燈（366 nm）下觀察，同時用未接種的MUG培養基作本底對照。若管內培養物呈現熒光，為MUG陽性；不呈現熒光，則為MUG陰性。觀察后，沿培養管的管壁加入數滴靛基質試液，若液面呈玫瑰紅色，為靛基質陽性；呈試劑本色，則為靛基質陰性。本底對照應為MUG陰性和靛基質陰性。

2.2.3 檢查方法的驗證 大腸埃希菌檢查方法驗證試驗結果見表3（表中“+”表示MUG陽性，“－”表示MUG陰性）。由表3可見，培養基稀釋法中，有1批樣品的陽性對照組結果呈陰性，表明該方法不能有效消除鹽酸頭孢他美酯對大腸埃希菌的抑制作用；而薄膜過濾法中，陰性對照及供試組的MUG和靛基質均呈陰性，陽性對照中2批樣品的MUG和靛基質均呈陽性，表明采用薄膜過濾法進行大腸埃希菌檢查的方法成立。

表3 大腸埃希菌檢查方法驗證試驗結果Tab 3 Verification results ofEscherichia coli test

上述結果顯示，鹽酸頭孢他美酯干混懸劑對細菌有一定抑制作用，采用薄膜過濾法，加入100 ml的沖洗液可以消除其抑制作用。這表明，采用薄膜過濾法可進行細菌計數及大腸埃希菌檢查，采用常規法可進行霉菌和酵母菌計數。

2.4 樣品檢查

根據微生物限度檢查法口服制劑規定，采用建立的微生物限度檢驗方法對2013年國內共19批鹽酸頭孢他美酯干混懸劑進行檢驗，結果均未檢出大腸埃希菌，部分樣品存在少量細菌污染，但未超出限度，且未檢出霉菌和酵母菌，合格率為100%。

3 討論

頭孢他美酯是通過口服吸收的有生物活性的頭孢他美的酯類前藥[7]，其進入腸壁和肝臟中被酯酶水解成頭孢他美后發揮其抗菌活性[8]。頭孢他美酯干混懸劑不溶于水，而采用離心沉淀法對供試品進行前處理則對樣品本身所含的微生物有一定影響[9]。因此，本研究采用靜置取上清液的方法制備供試液，以避免藥渣對薄膜過濾的干擾。在細菌計數和控制菌檢查試驗中，本品顯示了對大腸埃希菌的抗菌活性。該藥物本身僅具有較弱的抗菌活性[10]，由于體外缺乏酯酶，在溶液中不能完全水解成頭孢他美，導致活性受限。因此，可通過薄膜過濾加入100 ml的沖洗液進行細菌計數和控制菌檢查。

本研究發現，不同廠家的樣品對大腸埃希菌的體外抗菌活性存在差異，說明企業的生產工藝不同，導致產品在水溶液中的穩定性也不同。本研究為國內首個全面報道頭孢他美酯干混懸劑微生物限度檢查方法學的研究，并對國內2個廠家生產的樣品進行了檢驗，建立了可行、有效、統一的方法，可為該品種微生物限度檢查方法的收載提供借鑒。

[1]張淑華，歐真蓉，陳蜀，等.國產頭孢他美酯、頭孢他美酯體內外抗菌作用研究[J].中國抗生素雜志，2001，26（2）：144.

[2]傅穎君.鹽酸頭孢他美酯體外抗菌作用[J].江西醫學院學報，2002，42（3）：30.

[3]阮鄒榮，袁虹，孫凌，王選錠.鹽酸頭孢他美酯的藥代動力學研究[J].中國臨床藥理學雜志，2000，16（4）：301.

[4]周大偉，武海霞.鹽酸頭孢他美酯的藥理和臨床應用[J].張家口醫學院學報，2003，20（6）：46.

[5]余澤波，向小琴，王其南，等.國產頭孢他美酯片臨床觀察[J].重慶醫學，2000，29（5）：458.

[6]彭曉姍，唐映紅.鹽酸頭孢他美酯體內和體外抗菌作用研究[J].中國醫藥科學，2014，4（1）：33.

[7]俞紹鑫，吳朝倩.鹽酸頭孢他美酯的藥理與臨床應用[J].中國抗生素雜志，2001，26（2）：153.

[8]劉家健，劉敦茀，曾曉輝，等.國產鹽酸頭孢他美酯的制備[J].中國抗生素雜志，2001，26（2）：151.

[9]周劍，李霞.藥品微生物限度檢查法中幾種樣品前處理方法的可行性研究[J].中國藥房，2012，23（33）：3 136.

[10]高麗佳，楊俊卿，劉全，等.頭孢他美酯的體內抗菌作用研究[J].兒科藥學雜志，2001，7（2）：7.