紅酵母超高壓突變體的類胡蘿卜素提取及特性研究

王歲樓，王海翔，楊志萍，吳曉宗

(中國藥科大學食品科學與安全系，南京 211198)

以β-胡蘿卜素為代表的類胡蘿卜素具有抗氧化、抗腫瘤等許多重要的生理功能，在食品、藥品及保健食品等領域用途廣泛。利用紅酵母發酵生產天然類胡蘿卜素具有營養要求簡單、培養周期短、菌體可綜合利用等許多優點，但目前菌種發酵產率相對較低［1］。超高壓處理是一種非常有希望的食品工業高新技術，它不僅被用于食品殺菌保藏和品質改良，近年來也被用于食品發酵工業微生物的誘變育種［2］。本研究通過超高壓技術誘變獲得了類胡蘿卜素產量大幅度提高的紅酵母突變體［3，4］，并對其類胡蘿卜素的提取分離方法及光熱穩定性和抗氧化活性等進行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養基

菌種:酵母突變體，本實驗室保藏，系超高壓誘變獲得。

培養基(每1 000 mL):瓊脂培養基:葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、酵母膏10 g、瓊脂20 g，pH 值6.0;種子培養基:葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、酵母膏10 g，自然pH;發酵培養基:葡萄糖25 g、酵母膏3 g、硫酸銨5 g、番茄汁2.5 mL、花生油0.5 mL，pH 值6.0。

1.2 類胡蘿卜素提取分離和分析

發酵液離心獲得酵母菌體，用蒸餾水洗滌，在70℃干燥至恒重。根據前期研究經驗篩選了酸-熱法、甲苯法、酶解法、自溶法和機械法5 種細胞破壁方法［5］，并以丙酮為有機溶劑從細胞碎片中浸提類胡蘿卜素色素，直到菌體顏色消退。將提取液離心分離，上清液用濾膜過濾。

上述類胡蘿卜素粗提液通過硅膠柱色譜做進一步分離純化后，采用薄層層析法(TLC)、紫外光譜法和HPLC 法進行定量定性分析，具體方法參考文獻［6，7］，結合實際略有改動。

1.3 穩定性和抗氧化性評價

按照文獻［8］和［9］介紹的方法進行，略有改動。色素提取物的光、熱穩定性通過比色法測定;體外抗氧化活性通過化學發光法測定，比較清除幾種自由基的IC50值，其IC50值越大，表明其清除氧自由基能力越弱。

2 結果與討論

2.1 從紅酵母突變體提取類胡蘿卜素

類胡蘿卜素是紅酵母的胞內產物，必須先進行破壁處理。表1 是采用不同破壁方法提取類胡蘿卜素的產率，可見酸-熱法是其中最好的。其機制可能主要是由于鹽酸對細胞壁中原本結合緊密的多糖和蛋白質等物質具有強大的疏松作用，并結合沸水浴和速冷處理，使細胞壁結構被破壞，細胞內物質溶出。

表1 不同破壁方法類胡蘿卜素產率

進一步根據L9(34)正交試驗設計，獲得了酸-熱法破壁的最佳組合條件為:鹽酸濃度2 mol/L，鹽酸用量12 mL/g 細胞，鹽酸浸泡時間40 min，沸水浴處理4 min。另一項研究表明，類胡蘿卜素最佳提取溶劑為丙酮，其最佳用量為20 mL/g 干細胞。在以上確定的最優條件組合下，平均類胡蘿卜素提取率可達718.1 μg/g 干細胞(表2)。

表2 最適破壁和浸提條件下類胡蘿卜素提取結果

粗提物經柱分離純化后，用TLC、紫外光譜和HPLC 進行分析，結果表明，該突變體酵母類胡蘿卜素發酵產物中可能含有β-胡蘿卜素，還可能含有園酵母素、紅酵母紅素及其他不常見的類胡蘿卜素類物質(表3、表4)，而這些類胡蘿卜素的抗氧化、抗腫瘤活性目前還很少見文獻報道，因此值得進一步深入研究。

表3 薄層色譜和紫外光譜試驗結果

表4 3 種類胡蘿卜素標準混合物的HPLC 特性

2.2 類胡蘿卜素提取物的光熱穩定性及抗氧化活性

天然色素一般穩定性較差，嚴重制約了其實際應用。從表5、表6 可以看出，該類胡蘿卜素提取物對光和熱的穩定性好于以前報道的類似色素，這表明該酵母突變體的類胡蘿卜素有很大的實用價值，但超高壓處理后酵母色素光熱穩定性改善的原因有待今后研究。

類胡蘿卜素抗氧化活性是其最重要的功能特性，進行抗氧化作用研究是類胡蘿卜素應用的基礎。不同的類胡蘿卜素其抗氧化活性不同，即使相同類胡蘿卜素其來源不同，抗氧化活性也可能不同。從表7 可見，該色素提取物對3 種主要類型的氧自由基均有不同程度的清除作用，其中對·O-2 的清除能力最強，清除·OH 的能力次之，清除H2O2能力最弱。

表5 不同光源和照射時間對類胡蘿卜素穩定性的影響(OD475)

表6 不同溫度和加熱時間對類胡蘿卜素穩定性的影響(OD475)

表7 類胡蘿卜素對3 種自由基的清除能力

3 結論

采用酸-熱法破壁和丙酮為浸提溶劑，從紅酵母超高壓突變株提取類胡蘿卜素是可行的。色素提取物經過初步分離純化后，采用薄層色譜、紫外光譜和高效液相色譜進行分析，發現該色素提取物可能至少含有3 種類胡蘿卜素成分，包括β-胡蘿卜素、園酵母素及紅酵母紅素。穩定性實驗結果表明，該色素光熱穩定性良好，從體外自由基清除實驗也可看出，色素提取物具有良好的抗氧化活性，因此值得進一步開發研究。

［1］王歲樓，步芬.紅酵母發酵生產β-胡蘿卜素［J］.食品研究與開發，2010，31(12):250-254.

［2］王歲樓，王海翔.利用超高壓選育食品與發酵微生物的研究進展［J］.食品科學，2011，32(3):277-280.

［3］Wang SL，Sun JS，Han BZ.Optimization of β-carotene production by Rhodotorula glutinis using high hydrostatic pressure and response surface methodology ［J］.Journal of Food Science，2007，72(8):325-329.

［4］Wang SL，Chen DJ，Deng BW.Effects of high hydrostatic pressure on the growth and its β-carotene production of Rhodotorula glutinis ［J］.Yeast，2008，25(4):251-257.

［5］王歲樓，張鑫，張平之.紅酵母類胡蘿卜素的提取［J］.食品與機械，2000，6:30-31.

［6］Bhosale PB，Gadre RV.Production of β-carotene by Rhodotorula glutinis mutant ［J］.Applied Microbiology andBiotechnology，2001，55:423-427.

［7］Bhosale PB.Studies on yeast Rhodotorula，its carotenoids and their applications ［D］.Pune:University OF Pune，2001.

［8］粟敏，謝達平，李帥.紅酵母色素的穩定性和抗氧化性研究［J］.中國食物與營養，2008，7:25-28.

［9］王偉霞，李福后.紅酵母RY-8 菌株類胡蘿卜素與SOD 的純化及部分性質［J］.食品科技，2009，34(8):19-22.