內皮祖細胞與骨髓間充質干細胞構建血管化組織工程骨的研究進展

劉　歡(綜述)，周　煒，趙銥民(審校)

(軍事口腔醫學國家重點實驗室 第四軍醫大學口腔醫院修復科 陜西省口腔醫學重點實驗室，西安 710032)

內皮祖細胞與骨髓間充質干細胞構建血管化組織工程骨的研究進展

劉歡△(綜述)，周煒，趙銥民※(審校)

(軍事口腔醫學國家重點實驗室 第四軍醫大學口腔醫院修復科 陜西省口腔醫學重點實驗室，西安 710032)

摘要：組織工程骨早期血管化是促進形成新生骨的先決條件，骨髓間充質干細胞(BMSCs)是成骨細胞的起源，體外誘導條件下可分化為成骨細胞，是組織工程骨常用的種子細胞，但很難解決組織工程骨血管化的問題。內皮祖細胞(EPCs)作為內皮細胞前體細胞，已應用于多種缺血組織模型的血管再生研究。目前已有研究者將其引入組織工程骨構建體系，為解決組織工程骨血管化問題提供了新思路和方法。

關鍵詞：內皮祖細胞；骨髓間充質干細胞；組織工程骨；血管化

無法建立有效血供是組織工程骨研究的瓶頸問題。體內毛細血管僅能為周圍150 μm距離的組織供氧，如果不能很快建立血流灌注，就會引起骨組織中心壞死,因此構建血管化的組織工程骨是解決大面積骨缺損修復的基礎[1]。組織工程骨常用的種子細胞是骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)，但面臨血管化的問題。有學者將內皮細胞引入種子細胞，但終末分化細胞難以進行體外擴增培養，不能滿足骨組織血管化再生的需求。Asahara等[2]于1997年從外周血分離培養血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)。EPC可在心肌缺血、卒中等組織損傷和重構模型中發揮血管再生作用[3]。EPC主要通過分泌促血管生成因子和分化為成熟內皮細胞參與血管形成[4]。現就EPC與BMSC聯合構建血管化組織工程骨的研究進展予以綜述。

1EPC與BMSC的相互作用

1.2BMSC影響EPC形成血管結構的穩定性雖然在大量研究中發現EPC具有在體內形成血管網的功能，但也有研究表明，要形成穩定的血管網結構，EPC需要與血管周圍細胞共同作用[8]。生理狀態下，血管平滑肌細胞作為血管周圍細胞來構建穩定的血管結構。Melero-Martin等[8]研究發現，骨髓中的前體細胞在與EPC直接共培養后，開始表達平滑肌細胞標志物平滑肌重鏈肌球蛋白；裸鼠皮下實驗表明，共培養后的EPC與骨髓中的前體細胞形成了穩定的血管結構，而單純的EPC并未形成血管結構，且兩種細胞的比例影響著形成血管的功能。Fedorovich等[9]也發現，BMSC可促進EPC的增殖和成管腔結構的穩定性。因此，將EPC與BMSC作為種子細胞聯合應用構建組織工程骨可能會形成穩定的內部微循環，促進植入物與骨的整合。

1.3EPC影響BMSC成骨分化Li和Wang[10]將BMSC與EPC共培養并進行成骨誘導后，通過堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測盒、礦化結節染色發現，與單純BMSC成骨誘導相比，共培養組成骨能力提高，成骨早期標志ALP、Ⅰ型膠原和晚期標志骨鈣素、骨形成蛋白2表達增加。胰島素樣生長因子1是維持骨密度和促進EPC分化的重要因子，通過基因檢測發現，共培養組胰島素樣生長因子1表達明顯高于單純BMSC組和EPC組，從而發現EPC/BMSC共培養系統可促進胰島素樣生長因子1的分泌，利于成骨能力的提高[10]。Fedorovich等[9]也發現，外周血來源的EPC可促進體外培養的BMSC的成骨分化。Zhang等[11]構建BMSC成骨誘導膜片后，于膜片上滴加EPC細胞懸液，再將含有EPC的膜片折疊卷曲成圓柱，植入裸鼠皮下，并以單純BMSC成骨誘導膜片為對照，4周后和8周后取材，顯微CT發現實驗組骨密度大于對照組，組織切片發現實驗組可形成過多的骨樣組織和血管。雖然兩種細胞的起源有密切聯系，共同作用時可互相促進，但在EPC和BMSC共培養中，培養條件不同，BMSC 的分化狀態會受到影響。Rouwkema等[12]研究發現，臍帶血來源的EPC和BMSC共培養時，BMSC向內皮細胞分化，并能形成管腔樣結構，表達內皮系標志CD31，吞噬低密度脂蛋白，在體內形成可灌流的血管，但在3D培養體系，未經誘導的BMSC不能形成血管結構。Usami等[13]研究發現，成骨誘導液中增加EPC的專用培養基提高了BMSC的ALP活性，但添加了培養EPC的條件培養基后并未發現BMSC的ALP活性有所變化，但當條件培養基增加到50%時，其ALP活性下降。EPC專用培養基中還有血管內皮生長因子等能促進成骨分化的因子，EPC也能分泌部分因子，所以EPC條件培養基的促成骨作用在此體外實驗中可能被專用培養基所掩蓋。但EPC分泌的部分因子可能具有抑制成骨作用的因子，因而造成條件培養基所占比例增加到50%時，ALP活性有所下降[13]。但增加條件培養基與共培養不同，共培養的EPC有持續分泌的作用。因此，EPC影響BMSC成骨分化的機制仍需進一步研究。

2EPC與BMSC構建血管化組織工程骨支架材料的選擇

2.1β-磷酸三鈣(β-tricalcium phosphate，β-TCP)支架β-TCP 是一種生物相容性較好、在體內可生物降解的生物陶瓷。Henrich等[14]將EPC和BMSC共同接種于β-TCP支架，植入裸鼠股骨缺損處，10 d后發現，負載的細胞仍能表達成骨系基因標志物和內皮系基因標志物，說明兩種細胞仍能保持分化狀態。Seebach等[15]實驗發現，外周血早期EPC和BMSC 共同接種于β-TCP支架可提高骨缺損區的血管化，其主要原因是通過EPC分泌、釋放促進血管生成的因子(如血管內皮生長因子)，通過免疫熒光染色發現，人來源的EPC在裸鼠體內實驗中參與了植骨區血管形成。Seebach等[16]進一步構建大鼠極限骨缺損模型研究EPC對構建組織工程骨的作用，實驗發現，在1周時，EPC組和共培養組均形成了早期血管化，4周時，共培養組的骨形成顯著增加，8周時共培養組的骨性骨痂結構和極限載荷大于其他組，證明EPC對組織工程骨早期血管化及晚期骨化作用有明顯促進。還有學者也證明了共培養的細胞和材料復合體更好地促進了骨再生[17-18]。

2.2血小板-白細胞凝膠(platelet-leukocyte gel，PLG)修飾的陶瓷支架PLG成分包括富血小板血漿、白細胞及凝血酶、鈣劑等，通過凝血酶、鈣劑活化血小板后促進多種生長因子的釋放，從而促進創面愈合，加快骨的生長[19]。PLG可改善生物陶瓷的生物學活性。Geuze等[20]通過BMSC與EPC共培養，檢測了在體內和體外共培養對成骨的作用，在體外的共培養體系中發現兩種細胞間具有相互促進增殖的作用，在體內實驗中，通過將細胞負載于PLG或血漿修飾的陶瓷支架后植入山羊肌肉間，16周后發現，負載細胞組與材料組相比，增加了骨化作用，BMSC組及共培養組的效果之間無差異，兩組均好于EPC組；實驗同時發現，使用PLG比血漿更能促進骨形成。

2.3膠原纖維網支架膠原是構成結締組織的主要蛋白，膠原交聯形成膠原纖維，膠原纖維具有良好的生物相容性和生物降解性，利于維持細胞的黏附和生長。Usami等[13]使用聚乳酸包裹的膠原纖維網作為支架，于中央接種成骨誘導的BMSC，周圍接種EPC，植入裸鼠體內12周后取出檢測，發現接種了兩種細胞的支架表面和中央都形成了礦化組織，通過蘇木精-伊紅染色發現其骨組織比單純接種BMSC者更為成熟。EPC與BMSC共培養后可復合各種組織工程骨材料。但目前研究較多的是各種材料的骨引導與骨誘導的作用，對各種材料是否適合EPC黏附及成血管作用研究較少。EPC與BMSC共同構建血管化組織工程骨的研究仍處于起步階段，對各種不同材料之間的差別并未有學者展開詳細研究。

3EPC與BMSC構建血管化組織工程骨體外培養條件

在2D共培養體系中發現，人BMSC與臍帶血來源的EPC共同構建組織工程骨時，BMSC可向內皮細胞分化，表現內皮細胞特點(如形成管腔樣結構、CD31陽性、可吞噬低密度脂蛋白、于體內形成血管結構)；但在3D共培養體系中，BMSC不再表達CD31，也不再形成血管結構，共培養中的EPC仍能形成血管結構，但必須是分化成熟的EPC，且其效果要好于臍帶靜脈內皮細胞及微血管內皮細胞，因此認為，EPC可促進血管化組織工程骨的形成，但其分化狀態很重要[12]。Liu等[21]發現，應用生物反應器可促進人臍帶血來源的EPC和骨髓來源的BMSC負載大孔材料的成血管和成骨作用，動態培養的BMSC具有更好的礦化作用；在促進成血管方面，體外研究未發現其成血管優勢，但植入裸鼠皮下后發現，動態培養的復合體中，人與鼠細胞嵌合現象是靜態培養的1.4倍，且細胞分布更均勻，早期的血管滲入及更強的異位骨再生能力顯示出動態共培養的優勢。3D動態培養與2D靜態培養相比，在構建組織工程骨中有明顯優勢，能夠顯著提高支架上細胞的活性并促進骨形成[21-22]。尤其在構建大面積組織工程骨時，靜態培養條件很難滿足材料中央細胞的營養供應，3D動態培養則顯示出極大優勢。此外，動態培養使內皮細胞暴露于剪切力環境，從而影響內皮細胞的基因轉錄、增殖、出芽及血管穩態[21，23]。

體外培養中培養液的選擇對細胞也有較大影響。BMSC需經過成骨誘導才能成為成骨前體細胞，而在BMSC與EPC共培養時，有研究者發現，EPC不能在骨誘導液中存活，但也有研究者在共培養體系中使用成骨誘導液[13]。有學者為避免成骨誘導液對EPC的影響，先對BMSC進行成骨誘導后再與EPC共培養[11]。也有學者因內皮培養液中含有促進成骨的因子,而直接使用內皮培養基來進行BMSC和EPC共培養[24]。如何選擇共培養的培養液，目前也無最優方法。因此，需要研究發現最適合促進成骨和成血管的培養方法。

4小結

骨的修復與再生需要血管和骨細胞在時間和空間上相互影響及緊密配合，因此必須關注組織工程骨的血管化。雖然在BMSC與EPC共同構建組織工程骨中存在各種需要進一步探索的問題和優化的細節，但現有的研究已發現這種新型的組織工程骨在促進成骨和成血管方面有極大潛力。相信隨著體外共培養技術的不斷改進、人工材料的不斷改善，EPC和BMSC共同作為種子細胞將為組織工程方法修復大面積骨缺損提供可能性。

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Research Advances of Vasicularisation of Tissue Engineered Bone Established by Endothelial Progenitor Cells and Bone Mesenchymal Stem Cells

LIUHuan,ZHOUWei,ZHAOYi-min.

(StateKeyLaboratoryofMilitaryStomatology,DepartmentofProsthodontics,SchoolofStomatology,theFourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiKeyLaboratoryofStomatology,Xi′an710032,China)

Abstract：Early vascularization of a composite is a prerequisite for induction of new bone.However,bone mesenchymal stem cells(BMSCs),as the classical seed cells for bone tissue engineering,failed to meet the requisition for establishing the vascularity and hampered the clinical applications of bone tissue engineering.Endothelial progenitor cells (EPCs) could constitute a valid alternative to MSCs and improve the vascularization process by differentiating into ECs and secreting angiogenic growth factors.The coculture of EPCs and MSCs displays a promising approach to improve early vascularization of tissue engineered bone.

Key words：Endothelial progenitor cells；Bone mesenchymal stem cells； Bone tissue engineering； Vascularization

收稿日期：2015-02-26修回日期：2015-04-25編輯：鄭雪

基金項目：國家自然科學基金(81271104)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.002

中圖分類號：R783.9

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)23-4228-03