孕期大鼠急性胰腺炎病因及病理變化的相關(guān)研究

張　旋，劉　毅，李　斌，柯麗娜，王瑩利，黃亞雄

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院 a.婦產(chǎn)科,b.泌尿外科,湖北 十堰 442008)

孕期大鼠急性胰腺炎病因及病理變化的相關(guān)研究

張旋a，劉毅b※，李斌a，柯麗娜a，王瑩利a，黃亞雄a

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院 a.婦產(chǎn)科,b.泌尿外科,湖北 十堰 442008)

摘要：目的探討孕期大鼠急性胰腺炎病因及病理變化的相關(guān)情況。方法選擇2013年2月至2015年1月由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院實驗動物中心提供的健康性成熟SD雌性大鼠48只，雄性大鼠24只，按雌雄比2∶1合籠進(jìn)行交配，發(fā)現(xiàn)有陰道栓后記為孕期第1日，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為實驗組和對照組，各24只。對照組孕后繼續(xù)進(jìn)行自由喂養(yǎng)，而實驗組在孕期第7日建立急性胰腺炎模型。實驗組在造模后6、12、24 h(對照組在相應(yīng)時間點(diǎn))進(jìn)行肺濕重系數(shù)測定、肺組織的組織學(xué)評分、肺組織細(xì)胞凋亡測定及肺組織Bax和Bcl-2 mRNA測定，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，與對照組相比實驗組的胰腺組織壞死明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤，造模獲得成功。實驗組造模后相應(yīng)時間點(diǎn)的肺濕重系數(shù)、肺損傷病理評分較對照組均顯著升高(P<0.01)。對照組肺組織僅見少量細(xì)胞凋亡，實驗組肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)較對照組顯著增加(P<0.01)。對照組的Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)均較弱，而實驗組的Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)較對照組各時點(diǎn)均顯著增強(qiáng)(P<0.01)。在實驗組中，Pearson相關(guān)分析顯示肺損傷病理學(xué)評分、肺濕重系數(shù)與肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)均呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論孕期大鼠急性胰腺炎可導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生、發(fā)展，而Bcl-2、Bax基因表達(dá)的改變參與了孕期大鼠急性胰腺炎肺損傷，可能是促進(jìn)肺組織細(xì)胞凋亡的重要因素。

關(guān)鍵詞：急性胰腺炎；妊娠；病理；肺損傷；大鼠

急性胰腺炎是比較常見的急腹癥之一，其中重癥急性胰腺炎的病死率為20.0%左右[1]。妊娠合并急性胰腺炎并不多見，但近年來有增多的趨勢，具有發(fā)病急、病死率高的特點(diǎn)，母親的病死率可高達(dá)30.0%左右，胎兒的病死率為15.0%左右[2]。業(yè)已證實,急性胰腺炎時急性肺損傷的發(fā)生率可高達(dá)65.0%左右，終致繼發(fā)急性呼吸窘迫綜合征達(dá)20.0%左右，是急性胰腺炎患者死亡的主要原因之一[3-4]。目前急性胰腺炎肺損傷的發(fā)生機(jī)制仍不完全清楚，在臨床治療上也頗為棘手，因此對孕期大鼠急性胰腺炎病因及病理變化的研究仍是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[5]。初步研究表明，當(dāng)發(fā)生急性胰腺炎時大量產(chǎn)生的內(nèi)毒素和細(xì)胞因子可通過促進(jìn)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，加重肺血管內(nèi)皮、肺泡上皮損傷而參與急性肺損傷的炎癥反應(yīng)過程[6-7]。而Bax基因與Bcl-2基因均是凋亡調(diào)控基因Bcl-2家族成員，其中Bax過度表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，而Bcl-2表達(dá)增多能阻遏細(xì)胞凋亡[8]。本研究通過制備孕期大鼠急性胰腺炎，研究不同時間點(diǎn)肺與胰腺病理損害情況，檢測Bax與Bcl-2表達(dá)情況，以探討孕期大鼠急性胰腺炎病因及病理變化的相關(guān)情況，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物與試劑選擇2013年2月至2015年1月由湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院實驗動物中心提供的健康性成熟SD大鼠(合格證書：SCX2012-011)雌性清潔級48只(體質(zhì)量180～220 g)。動物分籠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物房(22 ℃)，自由飲食，環(huán)境溫度、濕度適宜，給予規(guī)律光照(12 h∶12 h)。免疫組織化學(xué)染色試劑盒(SP9000系列)來自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Bax、Bcl-2與β-actin 的引物合成由大連TAKARA公司完成。

1.2 模型制備大鼠按雌雄比2∶1合籠進(jìn)行交配，發(fā)現(xiàn)有陰道栓后記為孕期第1日，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為實驗組和對照組，各24只。對照組孕后繼續(xù)進(jìn)行自由喂養(yǎng)，而實驗組在孕期第7日建立急性胰腺炎模型，大鼠在模型建立前12 h禁食，2%戊巴比妥鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：1021724 )(0.25 mL/100 g)經(jīng)腹腔注射麻醉后常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，正中切口入腹由膽胰管以0.1 mL/min勻速逆行注入5%牛磺膽酸鈉(0.1 mL/100 g)，見胰腺出現(xiàn)壞死樣改變后逐層關(guān)腹。

1.3觀察指標(biāo)肺濕重系數(shù)測定：在造模后6、12、24 h分別取大鼠左肺組織(每次取8只)，用電子天平稱濕重后，置90 ℃電熱干燥箱干燥1 h，72 h稱干重，肺濕重系數(shù)=(肺濕重-肺干重)/肺干重×100.0%。

肺組織的組織學(xué)評分：在造模后6、12、24 h也分別取大鼠的部分肺組織10%甲醛固定(每次取8只)，常規(guī)石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色(hematoxyin-eosin staining，HE)后在光鏡下觀察。肺組織的組織學(xué)評分參考[4]的評分標(biāo)準(zhǔn)，肺組織間質(zhì)及腔內(nèi)滲出物占據(jù)面積<15%為0分(正常)；15%～<25%為1分； 25%～<50%為2分； 50%～<75%為3分；75%～<100%為4分。

肺組織細(xì)胞凋亡測定：取上述時間點(diǎn)的部分肺組織，采用熒光素法測定，操作過程按試劑盒(上海生物工程有限公司生產(chǎn)，批號：109843)說明進(jìn)行。二氨基聯(lián)苯胺顯色后蘇木精復(fù)染，在顯微鏡下觀察，同一切片高倍鏡下取3個不同視野，分取3次平均值計算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100.0%。

肺組織Bax和Bcl-2 mRNA測定：取上述時間點(diǎn)的部分肺組織，總RNA的提取采用Trizol試劑提取方法，以β肌動蛋白為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增，Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平以聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物吸光度值/β肌動蛋白吸光度值的比值表示。

2結(jié)果

2.1病理形態(tài)學(xué)變化對比經(jīng)過觀察，相對于對照組，實驗組造模后6 h胰腺組織腫脹伴點(diǎn)狀出血點(diǎn)，12 h胰腺腫脹更加顯著，24 h大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)模糊，胰周可見大量脂肪組織。光鏡下觀察造模后6 h胰腺充血水腫明顯，12 h胰腺水腫伴充血出血、胰腺實質(zhì)大片凝固性壞死，24 h胰腺組織結(jié)構(gòu)模糊，胰周見大量脂肪組織充填，表示造模成功。見圖1。

a、b. 正常大鼠胰腺組織(a：HE染色 ×100；b：HE染色×200)

c、d. 急性胰腺炎組織(c:HE染色 ×100；d：HE染色 ×200)

圖1大鼠正常胰腺和急性胰腺炎組織形態(tài)

2.2 兩組大鼠肺濕重系數(shù)、肺組織學(xué)評分與肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較實驗組造模后6、12、24 h的肺濕重系數(shù)、肺損傷病理評分較對照組顯著升高(P<0.01)，實驗組肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增加(P<0.01)。見表1。

表1　兩組大鼠肺濕重系數(shù)、肺損傷病理評分和凋亡指數(shù)比較　±s)

對照組：孕后自然喂養(yǎng)；實驗組：孕期第7日建立急性胰腺炎模型

2.3兩組大鼠Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)比較對照組Bax和Bcl-2mRNA表達(dá)均較弱，而實驗組的Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)較對照組各時點(diǎn)均顯著增強(qiáng)(P<0.01)。見表2。

表2兩組大鼠肺組織Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)比較

組別BaxmRNA造模后6h造模后12h造模后24hBcl-2mRNA造模后6h造模后12h造模后24h對照組0.42±0.050.47±0.060.43±0.030.47±0.040.45±0.050.47±0.04實驗組0.70±0.060.72±0.080.67±0.060.96±0.111.02±0.080.81±0.07t3.4873.6843.0925.8377.2236.488P<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01

對照組：孕后自然喂養(yǎng)；實驗組：孕期第7日建立急性胰腺炎模型

2.4相關(guān)性分析在實驗組中，Pearson相關(guān)分析顯示肺損傷病理學(xué)評分、肺濕重系數(shù)與肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)均呈正相關(guān)(r=0.774,0.902,均P<0.05)。

3討論

急性胰腺炎是當(dāng)前作為一種潛在的致命性疾病，其發(fā)病率逐年上升。其中約20.0%的患者臨床表現(xiàn)比較兇險，可發(fā)展為重癥急性胰腺炎，病死率高達(dá)30.0%左右[9]。急性胰腺炎早期即可出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)綜合征，導(dǎo)致單個或多個臟器功能不全，肺是最常見受累器官，臨床上表現(xiàn)為急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征。孕期急性胰腺炎是急性胰腺炎的—個特殊類型，臨床并不多見，但其起病急，發(fā)展快，病程復(fù)雜，嚴(yán)重威脅母嬰健康，是妊娠合并外科急腹癥死亡的首位因素[10]。

孕期急性胰腺炎的病因目前尚未完全闡明，其主要因素為膽管疾患和飲酒，其他還有暴飲暴食、高鈣血癥、寄生蟲、損傷、高脂血癥等，此外一些腹部手術(shù)和藥物也可引起[11]。實驗研究表明，急性胰腺炎發(fā)生廣泛的胰腺腺泡細(xì)胞壞死，輕型急性胰腺炎則主要伴隨胰腺腺泡細(xì)胞凋亡而很少壞死[12]。本研究建立了孕期大鼠急性胰腺炎模型，通過病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，胰腺組織壞死明顯，大量炎性細(xì)胞浸潤，與人類急性胰腺炎改變極其相似，表明造模獲得成功。

肺損傷是一種肺泡毛細(xì)血管膜彌漫性損傷導(dǎo)致肺水腫和肺不張，臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥的綜合征。在急性胰腺炎中，胰腺的自身消化作用可引起胰腺結(jié)構(gòu)的破壞并繼發(fā)漸進(jìn)性的胰腺壞死，從而導(dǎo)致多器官損傷[13]。而多種細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)胰腺炎性損傷并與消化酶、溶酶體酶相互作用、相互促進(jìn)，最終產(chǎn)生嚴(yán)重的肺損傷。并且在胰腺炎發(fā)病過程中可產(chǎn)生過量的氧自由基，而過量的氧自由基可以引起微血管痙攣，損傷微血管內(nèi)皮細(xì)胞，使毛細(xì)血管通透性增加，導(dǎo)致和加劇肺部組織損傷[14]。本研究結(jié)果顯示，實驗組造模后相應(yīng)時間點(diǎn)的肺濕重系數(shù)、肺損傷病理評分較對照組均顯著升高(P<0.01)。對照組肺組織僅見少量細(xì)胞凋亡，實驗組肺組織凋亡細(xì)胞明顯增加。從機(jī)制上分析，急性胰腺炎時，胰酶異常激活造成胰腺細(xì)胞損傷，激活單核巨噬細(xì)胞，一方面加重胰腺損傷，另一方面引起肺損傷。并且發(fā)生急性胰腺炎時，中性粒細(xì)胞可大量積聚在肺組織內(nèi)并與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，當(dāng)被激活時可釋放多種有害物質(zhì)，從而導(dǎo)致胰腺實質(zhì)的損傷。同時在急性胰腺炎中，誘導(dǎo)凋亡可明顯減輕胰腺炎的病情，其中腺泡細(xì)胞的死亡方式?jīng)Q定了瀑布樣反應(yīng)的程度，進(jìn)而影響胰腺炎的病情輕重[15]。

在調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因中，Bax、Bcl-2是Bcl-2家族中兩個比較重要的成員。在胰腺炎發(fā)生時Bax表達(dá)明顯增強(qiáng)，具有促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的作用并且與胰腺炎病變程度呈負(fù)相關(guān)，而Bcl-2表達(dá)也增強(qiáng)，在胰腺炎發(fā)生時可能具有抑制導(dǎo)管上皮細(xì)胞凋亡，幫助胰腺炎后期組織修復(fù)、再生[16]。有學(xué)者在重癥急性胰腺炎大鼠中發(fā)現(xiàn)肺組織細(xì)胞Bax的表達(dá)隨病程的延長而漸增高，Bcl-2基因表達(dá)隨病程的延長而漸下降，認(rèn)為Bcl-2、Bax基因表達(dá)參與了重癥急性胰腺炎肺損傷的發(fā)病機(jī)制[17]。本研究結(jié)果顯示，對照組的Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)均較弱，而實驗組的Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)較對照組各時點(diǎn)均明顯增強(qiáng)(P<0.01)，表明Bax表達(dá)增加能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，保護(hù)受損胰腺腺泡細(xì)胞；而Bcl-2基因為抑制細(xì)胞凋亡的一個重要調(diào)控基因，其表達(dá)水平增加可促進(jìn)導(dǎo)管管狀復(fù)合體增生與修復(fù)。

急性胰腺炎的發(fā)病不僅局限于胰腺本身，還可累及全身，其中急性胰腺炎時大量釋放的內(nèi)毒素和細(xì)胞因子可通過誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致通透性性肺水腫的產(chǎn)生[18]。本研究結(jié)果顯示，實驗組肺損傷病理學(xué)評分、肺濕重系數(shù)與肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)均呈正相關(guān)(P<0.05)，說明細(xì)胞凋亡不僅在生理狀態(tài)下對急性胰腺炎肺組織分化及衰老細(xì)胞的清除起重要作用，而且還參與急性胰腺炎肺損傷的發(fā)病過程。

總之，孕期大鼠急性胰腺炎可導(dǎo)致肺損傷的發(fā)生、發(fā)展，而Bcl-2、Bax基因表達(dá)的改變參與了孕期大鼠急性胰腺炎肺損傷，可能是促進(jìn)肺組織細(xì)胞凋亡的重要因素。

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The Etiology and Pathological Changes of Acute Pancreatitis in Pregnancy Rats

ZHANGXuana,LIUYib,LIBina,KELi-naa,WANGYing-lia,HUANGYa-xionga.

(a.DepartmentofGynecologyandObstetrics,b.DepartmentofUrology,DongfengGeneralHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442008,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the etiology and pathological changes of acute pancreatitis in pregnancy rats.MethodsFrom Feb.2013 to Jan.2015 from Dongfeng General Hospital Experimental Animal Center，48 sexually mature female SD rats and 24 male rats,according to male and female ratio 2∶1 were put into cage mate,recoding as day 1 of pregnancy on the discovery of vaginal suppository,and were equally divided into experimental group and control group of 24 rats according to random number table method.The control group after pregnancy received continuous free feeding,the experimental group was set up acute pancreatitis model on gestation day 7.After modeling of 6,12,24 h in the experimental group (control group at the corresponding time points),the lung wet weight index,lung histological scores,apoptosis of lung tissue,the bax and Bcl-2 mRNA levels were measured,and correlation analysis was conducted.ResultsCompared with the control group,pathologic examination revealed evident pancreatic tissue necrosis in the experimental group,inflammatory cell infiltration,suggesting successful modeling.Experimental lung wet weight coefficients and pathologic lung injury score at the time points were significantly increased than the control group(P<0.01).In the control group only a small amount of lung tissue apoptosis was seen,the experimental group was significantly higher than the control group(P<0.01).Bax and Bcl-2 mRNA expression of the control group was weak,while the experimental group was significantly increased than the control group at each time point(P<0.01).In the experimental group,Pearson correlation analysis showed that pathological score of lung injury,lung wet weight index and lung apoptosis index were positively correlated(P<0.05).ConclusionAcute pancreatitis during pregnancy in rats may lead to the occurrence and development of lung injury,and Bcl-2,bax gene expression changes are involved in the lung injury,and acute pancreatitis during pregnancy may be an important factor in promoting apoptosis in lung cells.

Key words:Acute pancreatitis; Pregnancy; Pathology; Lung injury; Rats

收稿日期：2015-07-07修回日期：2015-10-09編輯：伊姍

基金項目：湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(B20102106)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.23.040

中圖分類號：R463-4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)23-4334-03