利用多重PCR技術檢測羊肉中摻雜狐貍?cè)獾姆椒ㄑ芯?/h1>
2015-03-10 13:22:09張全芳馬德源劉艷艷梁水美楊雪馮
山東農(nóng)業(yè)科學 2014年12期
張全芳+馬德源+劉艷艷+梁水美+楊雪+馮夢秋+史學芹+卞如如+李燕+岳鳴鳴+步迅
摘要：本研究根據(jù)山羊、綿羊和狐貍線粒體16S rRNA基因間序列差異，設計特異性引物，其擴增片段大小分別為401、450 bp和300 bp，從而可在一個PCR反應中同時鑒別山羊、綿羊和狐貍?cè)N源性成分，檢測靈敏度高。
關鍵詞：多重PCR；山羊；綿羊；狐貍；源性鑒定
中圖分類號：Q819+R155文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）12-0004-04
隨著人們生活水平的不斷提高，對肉產(chǎn)品的需求量越來越大。但肉制品摻雜摻假的現(xiàn)象屢見不鮮，摻假的方式包括摻兌、混入、抽取、假冒等手段。例如一些不法商家或個人為了追求自身利益用低價劣質(zhì)的肉冒充高價優(yōu)質(zhì)的肉，尤以摻雜異種肉（如用雞肉冒充豬肉，豬肉冒充牛羊肉等）的造假行為最為常見[1]。2013年5月份，公安部公布的一起食品安全犯罪案件顯示，不法商家將未經(jīng)檢驗的狐貍、水貂、老鼠等肉品摻雜至羊肉中，銷往上海等多地的農(nóng)貿(mào)市場。這些摻假肉類微生物嚴重超標，投入市場嚴重影響了消費者的健康。
目前，對肉類的鑒別方法主要有：顯微鏡觀察法，通過肉制品的味道、色澤、肉類的紋理等進行肉類來源的判別；蛋白質(zhì)檢測法，如等電聚焦電泳法、免疫法、酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、色譜法；DNA檢測法，如核酸探針雜交、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction-fragment length polymorphism，PCR-RFLP）分析、DNA 指紋分析和PCR 特異擴增[2]。基于顯微鏡及蛋白質(zhì)的鑒別方法需要豐富的經(jīng)驗，且具有極大的主觀性，主要用于生鮮肉類的鑒別。在熟肉制品中，蛋白質(zhì)遇高溫易變性，利用蛋白質(zhì)檢測法無法靈敏地檢測其肉質(zhì)種源。除此之外，這些方法存在成本高、工作量大、對檢測對象要求高等缺點。分子生物學鑒定中的DNA雜交法費時、昂貴且復雜，而PCR方法由于反應時間短，具有較高靈敏性、特異性和可鑒別性，已成為肉制品品種鑒別中最常用的方法[2，3]。目前，根據(jù)線粒體基因組DNA序列差異設計物種特異性引物建立的PCR與實時熒光PCR方法已有大量報道，且進入了中國權威的檢測技術標準[4，5]。PCR方法可以解決傳統(tǒng)方法中由于蛋白質(zhì)變性而失能的困難，多重PCR技術具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟簡便性的特點，使肉類及其制品種類鑒定成為可能[6]。
本研究根據(jù)動物線粒體16S rRNA基因的差異性位點，設計特異性引物，通過優(yōu)化PCR反應體系，建立了正向引物共用、反向引物特異的PCR反應體系，一次PCR反應可同時擴增出三個不同物種（綿羊、山羊、狐貍）的特異性片段。該方法具有較高的靈敏度和準確度，且操作簡單易行，有望成為常規(guī)檢測的有效方法。
1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1供試材料用于陽性對照的山羊肉和綿羊肉（生肉、熟肉制品）樣品及待檢測樣品購自濟南超市及市場，狐貍?cè)鈦碜耘钊R市新港街道辦事處劉家旺村狐貍養(yǎng)殖場。
1.1.2主要試劑和儀器動物組織基因組DNA提取試劑盒（DP304-02，天根）；2×Taq PCR Master Mix （TaKaRa），DNA Marker（DL2000，天根）；引物由上海Invitrogen公司合成。儀器：PCR擴增儀（Veritee96-well，TaKaRa公司）；核酸電泳儀（Power PA 200，Bio-Rad公司）；凝膠成像儀（Alpha Imager EP， Cell Bioscience公司）；臺式高速冷凍離心機（5430R，Eppendorf公司）。
1.1.3PCR引物的設計根據(jù)山羊、綿羊和狐貍線粒體16S rRNA基因序列（GenBank登錄號分別為AB044308.1、HM236185.1、DQ334815.1）設計并確定各自特異引物， 三個物種的編號分別為：山羊-SY、綿羊-MY、狐貍-H，具體信息見表1。
1.2試驗方法
1.2.1肉類總DNA的提取使用滅菌打孔器，采用三層五點取樣法在山羊肉、綿羊肉、狐貍?cè)夂痛龣z樣品的不同部位取樣，置于滅菌研缽中剪碎，加入液氮充分研磨。按照試劑盒說明進行基因組DNA提取。50 mg樣品的總DNA均溶解于100 μL TE 緩沖液中，于OD260/OD280測定吸光度值，計算DNA濃度和純度。
1.2.2PCR反應體系及擴增條件反應體系（25 μL）為：rTaq（2.5 U/μL）0.15 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL，SYS1 （2 μmol/L） 2.0 μL、SYA （2 μmol/L） 1.5 μL、MYA （2 μmol/L） 1.0 μL、HA （2 μmol/L）各2.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 12.85 μL。擴增條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。
1.2.3引物特異性試驗使用上述反應體系及條件，分別對3種目標肉類和兩兩等比例混合最終完全混合DNA標本及非目標肉類等材料（牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉、小麥）的DNA標本進行PCR擴增，對山羊、綿羊、狐貍?cè)豍CR引物的特異性進行驗證與比較，重復2次。
1.2.4摻雜肉類敏感性試驗將山羊、綿羊和狐貍?cè)獾娜駾NA分別用分光光度計將濃度定量到10 ng/μL，將山羊肉/狐貍?cè)狻⒕d羊肉/狐貍?cè)獍凑毡?的比例進行混勻，參照上述PCR反應體系及反應條件進行擴增檢測，重復2次。
2結果與分析
2.1山羊肉、綿羊肉和狐貍?cè)馊豍CR引物特異性試驗
PCR結果見圖1，山羊肉、綿羊肉和狐貍?cè)夥謩e得到401、450、300 bp的單一條帶，無非特異性雜帶；山羊肉/綿羊肉、山羊肉/狐貍?cè)狻⒕d羊肉/狐貍?cè)狻⑸窖蛉?綿羊肉/狐貍?cè)獾幕旌螪NA擴增條帶清晰，能夠清楚分辨不同肉類來源的條帶；而小麥、牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉及空白對照均沒有擴增出條帶，說明引物的特異性強。
2.2山羊肉、綿羊肉和狐貍?cè)馊豍CR摻雜肉類敏感性試驗
將狐貍?cè)釪NA分別按1%、2%、4%、5%、10%、20%、40%比例與綿羊肉DNA和山羊肉DNA混合，按照上述方法進行PCR擴增并電泳檢測擴增效果。從圖2可以看出，在綿羊肉混合狐貍?cè)鈾z測試驗中，該引物對能在山羊肉中特異性地檢測出含量高于2%的狐貍?cè)獬煞帧膱D3可以看出，在山羊肉混合狐貍?cè)鈾z測試驗中，該引物對能在山羊肉中特異性地檢測出含量高于20%的狐貍?cè)獬煞帧＝Y果顯示狐貍?cè)夂途d羊肉摻雜在一起的檢測敏感性要比山羊肉和狐貍?cè)鈸诫s在一起的檢測敏感性高。
3討論
在動物源性成分鑒定中，多重PCR技術是較為常用的鑒定方法之一。多重PCR是在同一PCR反應體系里加上兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應。以多重PCR為基礎的肉類成分鑒別技術具有檢測通量高、儀器設備簡單、操作方便且檢測費用低的優(yōu)點，它解決了傳統(tǒng)方法中由于蛋白質(zhì)變性而失能的困難，還可以鑒定肉加工類樣品[7，8]。
本試驗在參考前人研究的基礎上，基于物種間線粒體16S rRNA基因的序列差異，建立了三種肉類成分快速檢測的多重PCR方法。本方法可以特異地分辨出綿羊肉、山羊肉、狐貍?cè)馊N不同的肉類源性成分，在綿羊肉中可以分辨出含量高于2%的狐貍?cè)猓谏窖蛉庵兄豢梢苑直娉龊扛哂?0%的狐貍?cè)猓赡苁怯捎谏窖蛉夂秃側(cè)饣蚪M存在競爭性擴增或者引物的設計及靶序列的選擇不當?shù)冉档土似潇`敏度。
目前，針對鴨肉、豬肉、雞肉和馬肉等可能摻假肉類的檢測已經(jīng)成熟[9～11]，對越來越復雜的羊肉摻假現(xiàn)象，相關檢測技術也在不斷發(fā)展。未來動物源性食品檢測技術的研究將致力于提高靈敏度和特異性，開發(fā)各種肉類配套的試劑盒產(chǎn)品，這樣對于各種動物源性肉類及肉制品的檢測將會更加系統(tǒng)快捷。
參考文獻：
[1]劉帥帥，李宏，羅世芝，等. PCR 技術在肉類摻假檢驗中的應用進展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報， 2011， 2（6）： 280-284.
[2]王建昌，王金鳳，陳瑞春，等. 鴨肉冒充牛羊肉的分子生物學檢測[J].肉類研究， 2012， 6（21）：20-23.
[3]王可，張玉玉，崔緒奎，等.微衛(wèi)星分子標記鑒別羊肉真?zhèn)畏椒ǖ慕⒓皯肹J].山東農(nóng)業(yè)科學，2014，46（6）：16-18.
[4]何瑋玲， 張馳， 楊靜，等. 食品中4種肉類成分多重PCR的快速鑒別方法[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2012， 45（9）：1873-1880.
[5]尚柯，段慶梓，張玉，等. 多重PCR法用于畜肉源性鑒定的研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（8）：83-96.
[6]曾少靈， 秦智鋒， 阮周曦，等. 多重實時熒光PCR檢測牛、山羊和綿羊源性成分[J]. 生物工程學報， 2009， 25（1）： 139-146.
[7]王麗媛， 葉建榮， 李興民，等. PCR技術檢測食品與飼料中動物源成分[J]. 保鮮與加工， 2006， 6（4）：33-36.
[8]羅家琴，王加啟，卜登攀，等. 飼料中牛、羊、豬、雞源性成分的PCR檢測方法及其應用[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2008， 41（7）：2112-2119.
[9]Matsunaga T， Chikuni K， Tanabe R， et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay [J]. Meat Science， 1999， 51（2）：143-148.
[10]馮海永， 韓建林. 羊肉產(chǎn)品中若干動物源性成分的七重PCR檢測技術應用研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2010，37（9）：85-90.
[11]李杰，喬緒穩(wěn)，余興龍，等. 快速鑒定豬肉和牛肉多重PCR方法的建立及初步應用[J]. 湖南畜牧獸醫(yī)， 2011 （2）：13-15.
張全芳+馬德源+劉艷艷+梁水美+楊雪+馮夢秋+史學芹+卞如如+李燕+岳鳴鳴+步迅
摘要：本研究根據(jù)山羊、綿羊和狐貍線粒體16S rRNA基因間序列差異，設計特異性引物，其擴增片段大小分別為401、450 bp和300 bp，從而可在一個PCR反應中同時鑒別山羊、綿羊和狐貍?cè)N源性成分，檢測靈敏度高。
關鍵詞：多重PCR；山羊；綿羊；狐貍；源性鑒定
中圖分類號：Q819+R155文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）12-0004-04
隨著人們生活水平的不斷提高，對肉產(chǎn)品的需求量越來越大。但肉制品摻雜摻假的現(xiàn)象屢見不鮮，摻假的方式包括摻兌、混入、抽取、假冒等手段。例如一些不法商家或個人為了追求自身利益用低價劣質(zhì)的肉冒充高價優(yōu)質(zhì)的肉，尤以摻雜異種肉（如用雞肉冒充豬肉，豬肉冒充牛羊肉等）的造假行為最為常見[1]。2013年5月份，公安部公布的一起食品安全犯罪案件顯示，不法商家將未經(jīng)檢驗的狐貍、水貂、老鼠等肉品摻雜至羊肉中，銷往上海等多地的農(nóng)貿(mào)市場。這些摻假肉類微生物嚴重超標，投入市場嚴重影響了消費者的健康。
目前，對肉類的鑒別方法主要有：顯微鏡觀察法，通過肉制品的味道、色澤、肉類的紋理等進行肉類來源的判別；蛋白質(zhì)檢測法，如等電聚焦電泳法、免疫法、酶聯(lián)免疫吸附實驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、色譜法；DNA檢測法，如核酸探針雜交、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction-fragment length polymorphism，PCR-RFLP）分析、DNA 指紋分析和PCR 特異擴增[2]。基于顯微鏡及蛋白質(zhì)的鑒別方法需要豐富的經(jīng)驗，且具有極大的主觀性，主要用于生鮮肉類的鑒別。在熟肉制品中，蛋白質(zhì)遇高溫易變性，利用蛋白質(zhì)檢測法無法靈敏地檢測其肉質(zhì)種源。除此之外，這些方法存在成本高、工作量大、對檢測對象要求高等缺點。分子生物學鑒定中的DNA雜交法費時、昂貴且復雜，而PCR方法由于反應時間短，具有較高靈敏性、特異性和可鑒別性，已成為肉制品品種鑒別中最常用的方法[2，3]。目前，根據(jù)線粒體基因組DNA序列差異設計物種特異性引物建立的PCR與實時熒光PCR方法已有大量報道，且進入了中國權威的檢測技術標準[4，5]。PCR方法可以解決傳統(tǒng)方法中由于蛋白質(zhì)變性而失能的困難，多重PCR技術具有高效性、系統(tǒng)性和經(jīng)濟簡便性的特點，使肉類及其制品種類鑒定成為可能[6]。
本研究根據(jù)動物線粒體16S rRNA基因的差異性位點，設計特異性引物，通過優(yōu)化PCR反應體系，建立了正向引物共用、反向引物特異的PCR反應體系，一次PCR反應可同時擴增出三個不同物種（綿羊、山羊、狐貍）的特異性片段。該方法具有較高的靈敏度和準確度，且操作簡單易行，有望成為常規(guī)檢測的有效方法。
1材料與方法
1.1試驗材料
1.1.1供試材料用于陽性對照的山羊肉和綿羊肉（生肉、熟肉制品）樣品及待檢測樣品購自濟南超市及市場，狐貍?cè)鈦碜耘钊R市新港街道辦事處劉家旺村狐貍養(yǎng)殖場。
1.1.2主要試劑和儀器動物組織基因組DNA提取試劑盒（DP304-02，天根）；2×Taq PCR Master Mix （TaKaRa），DNA Marker（DL2000，天根）；引物由上海Invitrogen公司合成。儀器：PCR擴增儀（Veritee96-well，TaKaRa公司）；核酸電泳儀（Power PA 200，Bio-Rad公司）；凝膠成像儀（Alpha Imager EP， Cell Bioscience公司）；臺式高速冷凍離心機（5430R，Eppendorf公司）。
1.1.3PCR引物的設計根據(jù)山羊、綿羊和狐貍線粒體16S rRNA基因序列（GenBank登錄號分別為AB044308.1、HM236185.1、DQ334815.1）設計并確定各自特異引物， 三個物種的編號分別為：山羊-SY、綿羊-MY、狐貍-H，具體信息見表1。
1.2試驗方法
1.2.1肉類總DNA的提取使用滅菌打孔器，采用三層五點取樣法在山羊肉、綿羊肉、狐貍?cè)夂痛龣z樣品的不同部位取樣，置于滅菌研缽中剪碎，加入液氮充分研磨。按照試劑盒說明進行基因組DNA提取。50 mg樣品的總DNA均溶解于100 μL TE 緩沖液中，于OD260/OD280測定吸光度值，計算DNA濃度和純度。
1.2.2PCR反應體系及擴增條件反應體系（25 μL）為：rTaq（2.5 U/μL）0.15 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL，SYS1 （2 μmol/L） 2.0 μL、SYA （2 μmol/L） 1.5 μL、MYA （2 μmol/L） 1.0 μL、HA （2 μmol/L）各2.0 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 12.85 μL。擴增條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。
1.2.3引物特異性試驗使用上述反應體系及條件，分別對3種目標肉類和兩兩等比例混合最終完全混合DNA標本及非目標肉類等材料（牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉、小麥）的DNA標本進行PCR擴增，對山羊、綿羊、狐貍?cè)豍CR引物的特異性進行驗證與比較，重復2次。
1.2.4摻雜肉類敏感性試驗將山羊、綿羊和狐貍?cè)獾娜駾NA分別用分光光度計將濃度定量到10 ng/μL，將山羊肉/狐貍?cè)狻⒕d羊肉/狐貍?cè)獍凑毡?的比例進行混勻，參照上述PCR反應體系及反應條件進行擴增檢測，重復2次。
2結果與分析
2.1山羊肉、綿羊肉和狐貍?cè)馊豍CR引物特異性試驗
PCR結果見圖1，山羊肉、綿羊肉和狐貍?cè)夥謩e得到401、450、300 bp的單一條帶，無非特異性雜帶；山羊肉/綿羊肉、山羊肉/狐貍?cè)狻⒕d羊肉/狐貍?cè)狻⑸窖蛉?綿羊肉/狐貍?cè)獾幕旌螪NA擴增條帶清晰，能夠清楚分辨不同肉類來源的條帶；而小麥、牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉及空白對照均沒有擴增出條帶，說明引物的特異性強。
2.2山羊肉、綿羊肉和狐貍?cè)馊豍CR摻雜肉類敏感性試驗
將狐貍?cè)釪NA分別按1%、2%、4%、5%、10%、20%、40%比例與綿羊肉DNA和山羊肉DNA混合，按照上述方法進行PCR擴增并電泳檢測擴增效果。從圖2可以看出，在綿羊肉混合狐貍?cè)鈾z測試驗中，該引物對能在山羊肉中特異性地檢測出含量高于2%的狐貍?cè)獬煞帧膱D3可以看出，在山羊肉混合狐貍?cè)鈾z測試驗中，該引物對能在山羊肉中特異性地檢測出含量高于20%的狐貍?cè)獬煞帧＝Y果顯示狐貍?cè)夂途d羊肉摻雜在一起的檢測敏感性要比山羊肉和狐貍?cè)鈸诫s在一起的檢測敏感性高。
3討論
在動物源性成分鑒定中，多重PCR技術是較為常用的鑒定方法之一。多重PCR是在同一PCR反應體系里加上兩對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應。以多重PCR為基礎的肉類成分鑒別技術具有檢測通量高、儀器設備簡單、操作方便且檢測費用低的優(yōu)點，它解決了傳統(tǒng)方法中由于蛋白質(zhì)變性而失能的困難，還可以鑒定肉加工類樣品[7，8]。
本試驗在參考前人研究的基礎上，基于物種間線粒體16S rRNA基因的序列差異，建立了三種肉類成分快速檢測的多重PCR方法。本方法可以特異地分辨出綿羊肉、山羊肉、狐貍?cè)馊N不同的肉類源性成分，在綿羊肉中可以分辨出含量高于2%的狐貍?cè)猓谏窖蛉庵兄豢梢苑直娉龊扛哂?0%的狐貍?cè)猓赡苁怯捎谏窖蛉夂秃側(cè)饣蚪M存在競爭性擴增或者引物的設計及靶序列的選擇不當?shù)冉档土似潇`敏度。
目前，針對鴨肉、豬肉、雞肉和馬肉等可能摻假肉類的檢測已經(jīng)成熟[9～11]，對越來越復雜的羊肉摻假現(xiàn)象，相關檢測技術也在不斷發(fā)展。未來動物源性食品檢測技術的研究將致力于提高靈敏度和特異性，開發(fā)各種肉類配套的試劑盒產(chǎn)品，這樣對于各種動物源性肉類及肉制品的檢測將會更加系統(tǒng)快捷。
參考文獻：
[1]劉帥帥，李宏，羅世芝，等. PCR 技術在肉類摻假檢驗中的應用進展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報， 2011， 2（6）： 280-284.
[2]王建昌，王金鳳，陳瑞春，等. 鴨肉冒充牛羊肉的分子生物學檢測[J].肉類研究， 2012， 6（21）：20-23.
[3]王可，張玉玉，崔緒奎，等.微衛(wèi)星分子標記鑒別羊肉真?zhèn)畏椒ǖ慕⒓皯肹J].山東農(nóng)業(yè)科學，2014，46（6）：16-18.
[4]何瑋玲， 張馳， 楊靜，等. 食品中4種肉類成分多重PCR的快速鑒別方法[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2012， 45（9）：1873-1880.
[5]尚柯，段慶梓，張玉，等. 多重PCR法用于畜肉源性鑒定的研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（8）：83-96.
[6]曾少靈， 秦智鋒， 阮周曦，等. 多重實時熒光PCR檢測牛、山羊和綿羊源性成分[J]. 生物工程學報， 2009， 25（1）： 139-146.
[7]王麗媛， 葉建榮， 李興民，等. PCR技術檢測食品與飼料中動物源成分[J]. 保鮮與加工， 2006， 6（4）：33-36.
[8]羅家琴，王加啟，卜登攀，等. 飼料中牛、羊、豬、雞源性成分的PCR檢測方法及其應用[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2008， 41（7）：2112-2119.
[9]Matsunaga T， Chikuni K， Tanabe R， et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay [J]. Meat Science， 1999， 51（2）：143-148.
[10]馮海永， 韓建林. 羊肉產(chǎn)品中若干動物源性成分的七重PCR檢測技術應用研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)， 2010，37（9）：85-90.
[11]李杰，喬緒穩(wěn)，余興龍，等. 快速鑒定豬肉和牛肉多重PCR方法的建立及初步應用[J]. 湖南畜牧獸醫(yī)， 2011 （2）：13-15.
