LMX1A抑制胃癌細胞系MKN45的生長和成瘤能力的研究

馮莉　廉偉　謝蘊

(復旦大學附屬閔行醫院消化內科， *病理科， 上海　201199)

·論著·

LMX1A抑制胃癌細胞系MKN45的生長和成瘤能力的研究

馮莉廉偉謝蘊*

(復旦大學附屬閔行醫院消化內科，*病理科， 上海201199)

摘要目的：探討轉錄因子LMX1A(LIM homeobox transcription factor 1, alpha)對胃癌細胞系MKN45的生長及成瘤能力的影響。方法： 在胃癌細胞系MKN45中過表達LMX1A，檢測空載或LMX1A過表達MKN45的生長及其在小鼠皮下的成瘤能力。結果：LMX1A誘發MKN45凋亡的同時抑制其生長并且能夠顯著抑制MKN45在小鼠皮下的成瘤能力(P<0.05)。結論：LMX1A作為腫瘤抑制因子在胃癌的發生發展過程中可能發揮作用。

關鍵詞LMX1A；胃癌；MKN45

Study of LMX1A Inhibiting Growth and Tumorigenic Ability of MKN45 Gastric Cancer Cell LineFENGLiLIANWeiXIEYun*DepartmentofGastroenterology,*DepartmentofPathology,TheCentralHospitalofMinhangDistrict,FudanUniversity,Shanghai201199,China

AbstractObjective：To investigate the effect of LMX1A on growth and tumorigenic ability of MKN45 gastric cancer cell line. Methods:LMX1A was overexpressed in MKN45 gastric cancer cell line. And the proliferation and subcutaneous tumorigenic ability of MKN45 cell line with empty vector or overexpressed LMX1A in mice were detected. Results: LMX1A could induce the apoptosis of MKN45 and meanwhile inhibit its proliferation (P<0.05). Furthermore, overexpression of LMX1A could significantly inhibit subcutaneous tumorigenic ability of MKN45 cells in mice (P<0.05). Conclusions: LMX1A is a tumor suppressor in the development and progression of gastric cancer.

Key WordsLMX1A；Gastric cancer；MKN45

轉錄因子LMX1A (LIM homeobox trans-cription factor 1, alpha) 是包含LIM同源盒的基因家族的成員之一，它位于染色體1q24.1[1-2]。之前對敲除LMX1A基因小鼠的研究[3]發現，LMX1A是決定細胞分化命運的關鍵因子。在處于發育階段的小腦中，LMX1A的缺失幾乎完全阻滯了脊柱中神經管的發生[4]。LMX1A在腫瘤中的作用也逐漸被發現。比如，LMX1A能夠抑制宮頸癌的轉移[5]。LMX1A基因甲基化程度在宮頸鱗狀細胞癌組織中比正常宮頸組織中高[6]。Dong等[7]的研究也發現，胃癌組織中LMX1A基因的啟動子區發生高度甲基化，使LMX1A在癌組織中的表達低于癌旁組織，并且LMX1A在胃癌細胞系AGS中發揮腫瘤抑制作用。本研究探討了LMX1A對胃癌細胞系MKN45的生長及其成瘤能力的影響，以明確LMX1A的腫瘤抑制作用。

1資料與方法

1.1細胞培養胃癌細胞系MKN45購自中國科學院細胞庫，于含10%胎牛血清的DMEM培養基中在37℃、5%CO2條件下進行培養。

1.2質粒構建采用反轉錄聚合酶鏈反應法得到LMX1A cDNA，用特異性引物擴增后連入pCMV4-flag載體，得到pCMV4-flag-LMX1A質粒。

1.3蛋白質印跡用預先加有蛋白酶抑制劑Cocktail(美國Sigma公司)的哺乳動物細胞總蛋白抽提試劑(美國Pierce公司)從細胞中提取蛋白，然后進行蛋白質印跡實驗[7]。

1.4細胞凋亡檢測用胰酶消化細胞后離心，收集并懸浮于結合緩沖液中，然后分別加入膜聯蛋白(Annexin-Ⅴ，美國BD Pharmingen公司)和碘化丙啶(propidium iodide，PI，美國BD Pharmingen公司)，室溫標記15 min，用流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)收集熒光信號。

1.5克隆形成實驗在6 cm細胞培養皿底部鋪一層0.6%低熔點瓊脂糖，然后將含有1×103細胞的0.3%瓊脂糖混懸后鋪于其上。4周后，以直徑>1 mm為準計算克隆數量。

1.6皮下腫瘤形成實驗10只BALB/C裸鼠(購自中國科學院上海實驗動物中心)分別皮下注射1×106轉染pCMV4-flag-LMX1A質粒或pCMV4-flag質粒(空載)的MKN45細胞，每種細胞接種5只小鼠。腫瘤大小以公式V=4/3π×L/2×(W/2)2計算得出，其中L代表中軸長，W代表中軸寬[7]。

1.7統計學處理采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，組間比較采用Student’st-test，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1LMX1A在胃癌細胞系MKN45中過表達構建pCMV4-flag-LMX1A質粒(LMX1A過表達質粒)并轉染MKN45，觀察LMX1A表達增強對胃癌細胞系MKN45的影響，以pCMV4-fla質粒(空載質粒)作為對照。圖1示LMX1A在MKN45中成功表達。

圖1將pCMV4-flag質粒(空載)和pCMV4-flag-LMX1A質粒分別轉染入MKN45細胞中，得到空載細胞系MKN45-vector和LMX1A過表達細胞系MKN45-LMX1A，并用蛋白質印跡法檢測flag-LMX1A表達情況

2.2LMX1A過表達負調控胃癌細胞系MKN45的存活等量的細胞經過Annexin-Ⅴ和PI分別標記后，在流式細胞儀上進行檢測，結果發現，LMX1A過表達細胞中Annexin-Ⅴ單陽性細胞的比例顯著增加，而PI單陽性以及Annexin-Ⅴ和PI雙陽性的細胞比例沒有增加，見圖2A。LMX1A過表達使MKN45細胞凋亡增加(P<0.05)，見圖2B。

圖2空載細胞系MKN45-vector和LMX1A過表達細胞系MKN45-LMX1A進行Annexin-Ⅴ和PI雙標記后，用流式細胞儀檢測熒光信號(A)，并對3次實驗的熒光強度進行統計，計算細胞凋亡率(B，Student’st-test；與MKN45-vector比較，#P<0.05)

2.3LMX1A過表達負調控胃癌細胞系MKN45的增殖通過克隆形成實驗對空載和LMX1A過表達的MKN45細胞的生長情況進行觀察，結果發現,相對于空載細胞，LMX1A過表達細胞的增殖能力明顯減弱(P<0.05)，見圖3。

圖3空載細胞系MKN45-vector和LMX1A過表達細胞系MKN45-LMX1A分別進行克隆形成實驗(A)，并對3次實驗的結果進行統計(B，Student’st-test, 與MKN45-vector比較，#P<0.05)

2.4LMX1A過表達負調控胃癌細胞系MKN45的成瘤作用小鼠皮下腫瘤形成實驗結果顯示，LMX1A過表達的MKN45細胞的成瘤能力明顯低于空載細胞，見圖4。

圖4將空載細胞系MKN45-vector和LMX1A過表達細胞系MKN45-LMX1A分別注射入裸鼠皮下。4周后觀察皮下成瘤體積的差異(A)，測量后進行統計(B，Student’st-test, 與MKN45-vector比較，#P<0.05)

3討論

胃癌占全球腫瘤死因的第二位[8]。盡管已經發現蔬菜和水果攝入不足以及幽門螺旋桿菌感染等和胃癌的發生相關，但是目前胃癌發生發展的分子機制還有待進一步研究[9]。

LMX1A作為轉錄因子在發育過程中發揮重要作用。越來越多的發育相關轉錄因子被報道參與腫瘤的發生發展，如Twist[10]、Snail[11-12]及Elf5[13]等，但LMX1A在胃癌發生發展過程中的作用尚不明確。前期研究[7]發現，由于甲基化程度增加，LMX1A在胃癌組織中的表達較癌旁組織低。而且無論是在胃癌細胞系AGS[7]中還是本研究應用的胃癌細胞系MKN45中，LMX1A的過表達都能夠在引起細胞凋亡的同時抑制細胞生長，并抑制裸鼠皮下腫瘤的生成。以上結果證實，LMX1A在不止一種胃癌細胞系中具有腫瘤抑制作用，提示LMX1A在胃癌組織中表達的下降有利于腫瘤的發生。

腫瘤的發生發展包括腫瘤細胞的存活、生長和轉移等，而本研究只關注了LMX1A對胃癌細胞的存活和生長的影響，今后，我們將研究LMX1A對胃癌轉移的作用傾向。

參考文獻

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[11]Batlle E,Sancho E,Francí C,et al.The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells[J].Nat Cell Biol,2000, 2(2):84-89.

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基金項目：上海市自然科學基金項目(編號：10ZR1426300、134119b2600)

中圖分類號R 735.2

文獻標識碼A