17β 雌二醇對氯胺酮誘導發育期大鼠皮質神經細胞凋亡的影響

李建立 ，張秀果，常秀杰，容俊芳，蔚冬冬，吳紅海，侯艷寧

氯胺酮作為小兒麻醉時的常用藥物，其對發育期大腦的神經毒性，近年來引起了國內外學者的廣泛關注，因此尋找安全有效的措施來防治氯胺酮的發育期神經毒性變得十分迫切。我們的前期研究發現神經甾體17β 雌二醇可通過抗凋亡機制對氯胺酮誘導的原代培養皮質神經元凋亡產生保護作用［1］。但17β雌二醇是否對氯胺酮引起的發育期大鼠大腦皮質區神經細胞凋亡產生保護作用以及機制未見報道。本文對此進行了研究，為圍手術期應用17β 雌二醇防治氯胺酮的發育期神經毒性提供進一步的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗動物及分組 母鼠與出生7 日齡雄性SD 幼鼠均由河北醫科大學動物實驗中心提供(合格證號:1306107，體質量16～18 g)。30 只7 日齡雄性SD 幼鼠，隨機分為對照組(C 組)、氯胺酮組(K 組)、氯胺酮+17β 雌二醇組(K+E 組)，每組10只。C 組連續3 d 腹腔注射等容量生理鹽水;K 組連續3 d 腹腔注射75 mg/kg 氯胺酮;K +E 組連續3 d腹腔注射75 mg/kg 氯胺酮，同時皮下注射600 μg/kg 17β 雌二醇。麻醉后把幼鼠放在暖箱中同時給予低流量氧氣(2 L/min)，實驗過程密切觀察幼鼠的呼吸頻率以及皮膚顏色，各組幼鼠與母鼠的分離時間均為250 min［2］。

1.1.2 試 劑 氯胺酮(福建古田藥業有限公司提供，批號H35020148)，17β 雌二醇(美國sigma 公司)，Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3 抗體(Cell signaling 公司)，TUNEL(德國羅氏公司)。

1.2 方 法

1.2.1 TUNEL 法檢測發育期大鼠大腦皮質區神經凋亡 出生7 d 的SD 幼鼠經各組藥物處理24 h后，取額葉皮質腦組織經4% 多聚甲醛固定48 h，梯度乙醇脫水后，石蠟垂直定向包埋，切片(厚度為5 μm)。石蠟切片經過二甲苯浸泡3 次，梯度乙醇脫水(每次5 min)，然后自來水浸泡5 min，抗原修復20 min，自然冷卻。然后滴加3% H2O2去離子水，室溫孵育10 min，冷PBS 液沖洗3 次(每次5 min)。滴加正常山羊血清工作液，室溫孵育15 min，進行封閉。PBS 液清洗后，浸入通透液(0.1%Triton X-100 溶于0.1%檸檬酸鈉)冰上促滲10 min。然后加入50 μl TdT 酶置于CO2孵育箱中37 ℃反應1 h。PBS 液漂洗3 次(每次5 min)后，滴加50 μl Streptavidin-HRP 工作液，室溫孵育10 min。PBS 液漂洗3 次(每次5 min)，在樣本區域滴加100 μl DAB 工作液，直到呈現淺棕色背景。用去離子水漂洗兩次，用濾紙小心吸除載玻片上的多余液體，滴加幾滴甘油于樣本區域，然后蓋上蓋玻片進行封片。于倒置顯微鏡下任意選取5 個視野觀察TUNEL 陽性細胞并計數，計算神經元的凋亡率，凋亡率=(凋亡細胞數/細胞總數)×100%。

1.2.2 Western-blot 法檢測大鼠大腦額葉皮質區bcl-2、Bax 以及cleaved-caspase-3 蛋白的表達幼鼠經藥物處理24 h 后，取額葉皮質腦組織經勻漿，裂解液裂解細胞提取細胞總蛋白，BCA 法檢測樣品蛋白含量。取待測蛋白質50 μg 加上樣緩沖液煮沸變性，于10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中100 V 電泳1.5 h，轉膜2 h，加入bcl-2，Bax 以及cleaved-caspase-3 抗體(1∶ 2000)，4 ℃過夜，常規洗滌，加羊抗鼠二抗(1∶ 5000)37 ℃孵育60 min，洗滌，電化學法發光，顯影，掃描，用凝膠圖像處理系統分析目標條帶與內參照條吸光度的比值。實驗重復3 次，設β-actin 蛋白為內參。

2 結果

2.1 藥物處理后幼鼠一般情況變化 各組幼鼠在給藥過程中呼吸均勻，膚色紅潤，無1 例出現呼吸抑制。

2.2 17β 雌二醇對氯胺酮誘導大鼠大腦皮質區細胞凋亡的影響 與對照組比較，氯胺酮組大鼠大腦皮質區TUNEL 陽性細胞顯著性增加(P ＜0.01);與氯胺酮組比較，氯胺酮+17β 雌二醇組TUNEL 陽性細胞顯著性降低(P ＜0.01)(見圖1)。

2.3 不同處理對幼鼠大腦皮質區bcl-2 和Bax水平的影響 與對照組比較，氯胺酮組大鼠大腦皮質區bcl-2 蛋白水平顯著性下降(P ＜0.01)，Bax 蛋白水平顯著性增加(P ＜0.01)，Bcl-2/Bax 顯著性降低(P ＜0.01);與氯胺酮組比較，氯胺酮+17β 雌二醇組bcl-2 蛋白水平顯著性增加(P ＜0.01)，Bax 蛋白水平顯著性下降(P ＜0.01)，Bcl-2/Bax 顯著性增加(P ＜0.01)(見圖2)。

2.4 不同處理對幼鼠大腦皮質區cleavedcaspase-3 蛋白水平的影響 與對照組比較，氯胺酮組大鼠大腦皮質區cleaved-caspase-3 蛋白水平顯著性增加(P ＜0.01)。與氯胺酮組比較，氯胺酮+17β雌二醇組cleaved-caspase-3 蛋白水平顯著性下降(P＜0.01)(見圖3)。

圖1 不同處理對皮質區TUNEL 陽性細胞表達的影響(，n=6)

圖2 不同處理對bcl-2/Bax 的影響(，n=3)

圖3 不同處理對cleaved-caspase-3 水平的影響(，n=3)

3 討論

氯胺酮作為一種N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體拮抗劑，是小兒麻醉時最為常用的藥物。近年來大量研究表明氯胺酮可引起發育期大鼠大腦廣泛腦區凋亡樣損傷［2～4］。研究表明雌二醇作為一種內源性神經活性甾體在大腦早期發育中發揮著十分重要的調節作用，同時對發育期多種神經損傷可產生神經保護作用［5～7］。我們以往的研究結果表明17β 雌二醇可對氯胺酮誘導的原代培養皮質神經元產生保護作用［1］。由于利用培養細胞進行的體外實驗有一定的局限性，比如缺乏機體對外界環境變化的內分泌調節功能，所以本研究進一步以大腦處于快速發育期的7 日齡SD 雄性幼鼠作為研究對象，從動物整體研究17β 雌二醇是否對氯胺酮引起的發育期大鼠皮質區神經細胞凋亡產生保護作用以及機制，以期為臨床應用17β 雌二醇預防氯胺酮對發育期大腦的神經損傷提供進一步的實驗依據。

大鼠大腦快速發育期處于產后7 d 左右，在此期間神經突觸高度活躍，突觸連接廣泛建立，這一時期的神經元對外界刺激包括全身麻醉藥的神經毒性最為敏感，也最容易受到損傷。因此本實驗選擇出生7 d 的新生雄性SD 幼鼠作為研究對象，此時大腦發育階段相當于人類的新生兒期［8］。本研究采用連續3 d 75 mg/kg 氯胺酮腹腔注射來研究氯胺酮對發育期大腦皮質神經細胞凋亡的影響［2］。由于全身麻醉藥易造成呼吸抑制，缺氧成為影響動物實驗結果的重要因素。以往研究表明80 mg/kg 是單次注射氯胺酮而維持大鼠脈搏氧飽和度(SpO2)在正常范圍的最高劑量［9］。同時在整個實驗過程中我們嚴密監測幼鼠的呼吸情況，同時給予低流量氧氣供應避免了因缺血、缺氧引起的神經細胞凋亡。

目前研究認為氯胺酮通過凋亡機制引起發育期大腦神經損傷［10］。凋亡發生受凋亡調控蛋白的控制，凋亡調控蛋白分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩大類。研究表明bcl-2 和Bax 蛋白水平高低與凋亡發生直接相關，凋亡的發生由bcl-2 與Bax 的比率決定［11，12］。Caspase-3 是凋亡發生的最終執行者，Bcl-2通過抑制線粒體細胞色素C 以及caspase-3 的活化產生抗凋亡作用［13］。Bax 作為線粒體膜上離子通道的重要組成成分，使細胞色素C 穿過線粒體膜，激活caspase-9，進一步激活caspase-3，最終導致細胞凋亡。

本研究采用連續3 d 75 mg/kg 氯胺酮腹腔注射引起發育期大鼠大腦皮質區TUNEL 陽性細胞的大量增加，證明了連續大劑量氯胺酮可引起發育期大鼠皮質區神經細胞凋亡的發生。17β 雌二醇與氯胺酮共處理組皮質區TUNEL 陽性細胞較氯胺酮組明顯下降，說明17β 雌二醇可對氯胺酮導致的發育期大鼠大腦皮質區神經細胞凋亡產生保護作用。Western-blot 結果顯示與對照組比較，氯胺酮組抗凋亡蛋白bcl-2 表達顯著下降，促凋亡蛋白Bax 表達顯著增加，Bcl-2/Bax 比值顯著降低，cleaved-caspase-3表達顯著增加。與氯胺酮組比較，17β 雌二醇與氯胺酮共處理組抗凋亡蛋白bcl-2 表達顯著增加，Bax表達顯著降低，Bcl-2/Bax 比值顯著增加，cleavedcaspase-3 表達顯著下降。以上結果充分表明17β雌二醇抑制氯胺酮引起發育期大鼠皮質神經細胞凋亡的機制可能與下調Bax、cleaved-caspase-3 和上調bcl-2 的蛋白水平，升高bcl-2/Bax 比值有關，但它對其他凋亡相關蛋白是否也有作用以及相關機制，還需要進一步研究。

總之，17β 雌二醇可對氯胺酮誘導的發育期大鼠大腦皮質區神經細胞凋亡產生保護作用，其機制可能與影響bc1-2 和Bax 蛋白水平有關。本研究進一步在動物整體證實了17β 雌二醇可對氯胺酮發育期神經毒性產生保護作用，為圍術期應用17β 雌二醇防治氯胺酮對嬰幼兒大腦產生神經損傷提供了更為直接的實驗依據。

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