大鼠增殖抑制基因通過Ras-Raf-MEK-ERK 信號通路抑制C6 膠質瘤細胞增殖

蔣樹財 ，鄒有瑞，高 鵬，郭 暉，霍國進，4，王軍成，4，趙 巍，沈 冰

神經(jīng)膠質瘤來自神經(jīng)上皮組織，在顱內(nèi)惡性腫瘤中最為常見，預后極差，嚴重威脅著人類的健康。大鼠增殖抑制基因(rat hyperplasia suppressor gene，rHSG)又名線粒體融合基因2(mitofusin-2，Mfn2)，可以顯著抑制血管平滑肌細胞增殖，其機制與抑制Ras-Raf-MEK-ERK 信號傳導通路的激活有關［1～4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，rHSG 蛋白過表達可以顯著抑制大鼠膠質瘤C6 細胞增殖，阻滯細胞周期，但其抗腫瘤機制尚未深入研究［5，6］。Ras-Raf-MEK-ERK信號傳導通路與細胞周期調節(jié)聯(lián)系密切，它的過度激活與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關，現(xiàn)今已成為研究抗腫瘤藥物靶點，且已有實驗性藥物問世［7］，但其與rHSG 抗膠質瘤細胞增殖的相關研究未見報道。故本實驗針對Ras-Raf-MEK-ERK 信號通路在rHSG 抗C6 細胞增殖中的作用進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料 C6 細胞和Adv-rHSG-GFP、Adv-GFP 病毒純化液由寧夏醫(yī)科大學顱腦重點實驗室保存;胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)液購自美國HyClone 公司;細胞DNA 含量(細胞周期)即時檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司;Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司;Maxima SYBR Green Qpcr Master Mix(2 ×)、First Strand cDNA Synthesis Kit，購自美國Thermo 科技有限公司;小鼠抗大鼠rHSG 單克隆抗體購自美國Abcam 公司;兔抗大鼠H-ras、N-ras、Kras 單克隆抗體購自美國Abcam 公司;兔抗大鼠Erk1/2、p-Erk1/2、Rb、p-Rb 單克隆抗體購自美國CST 公司;小鼠抗大鼠，羊抗大鼠GAPDH 多克隆抗體購自北京全式金生物技術公司公司;羊抗兔IgG抗體購自中衫金橋生物技術有限公司，羊抗小鼠、羊抗兔IgG 熒光抗體購自Odyssey 科技公司;全蛋白提取試劑盒和BCA 蛋白定量檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) C6 細胞由本實驗室保存，復蘇細胞后置于含10%的FBS(Hyclone)的高糖DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中，在37 ℃、95% O2/5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 代，細胞活性恢復后進行試驗。

1.2.2 細胞分組及轉染 將C6 細胞分空白對照組(PBS)、腺病毒載體對照組(Adv-GFP)、rHSG過表達組(Adv-rHSG-GFP)3 組;C6 細胞以1 ×106個/皿種于60 mm 規(guī)格的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12 h，用含0.2%FBS 的DMEM 同步化24 h;Adv-rHSG-GFP、Adv-GFP 組以劑量效應實驗得出的最適轉染復數(shù)(MOI=100)進行腺病毒轉染4 h 后棄去培養(yǎng)液，換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h;PBS 組用PBS 緩沖液代替病毒液，4 h 后棄去培養(yǎng)液，換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培72 h。

1.2.3 倒置的熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的表達 腺病毒轉染C6 細胞24 h，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況后，用胰酶消化細胞，制成單細胞懸液，流式細胞儀(BD-FACSVerseTM)檢測綠色熒光的強度，檢測病毒轉染效率。

1.2.4 細胞周期分析 將病毒轉染后C6 細胞制備成單細胞懸液，加入70% 乙醇固定過夜，RNA 酶37 ℃消化30 min，400 目篩網(wǎng)過濾，PI 4 ℃染色30 min，流式細胞儀(BD-FACSVerseTM)分析細胞周期。

1.2.5 IGF-1 刺激C6 細胞 腺病毒轉染C6后48 h、72 h，以10 ng/ml 濃度的IGF-1 刺激C6 細胞15 min 后立即終止刺激(經(jīng)預實驗，IGF-1 以10 ng/ml濃度刺激15 min，能有效激活C6 細胞的Ras-Raf-MEK-ERK 通路，p-Erk1/2 磷酸化蛋白表達增多;PBS 組以同樣條件處理)，收集細胞，以備QRT-PCR 和Western blot 分析。

1.2.6 qRT-PCR 分析 TRIZOL Reagent (Invitrogen)提取IGF-1 刺激后C6 細胞的總mRAN，進行逆轉錄，按Thermo 的Maxima SYBR GreeC/ROX Qpcr Master Mix(2 ×)說明書進行H-ras、N-ras、Kras、Erk1、Erk2 基因的擴增，儀器為BIO-RAD 熒光定量PCR 儀，軟件系統(tǒng)為Bio-Rad CFX MaCager。

1.2.7 Western blot 分析 收集到的細胞加入適量裂解液裂解，采用BCA 法檢測蛋白濃度，加上樣緩沖液后95 ℃8 min 使蛋白變性。以30 μg/20 μl體系上樣，進行SDS 聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE);PVDF 膜牛奶封閉后，加入rHSG、Hras、N-ras、K-ras、p-Erk1/2、Erk1/2、p-Rb、Rb 蛋白特異性一抗孵育，加入相應的二抗雜交;化學發(fā)光法進行顯色反應，暗室曝光后Bio-rad 凝膠成像系統(tǒng)掃描膠片成像，或Odyssey Infrared Imaging 儀掃描。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗的結果檢測都重復3次及3 次以上(n≥3)，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，選用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件包分析，同時間點組內(nèi)比較使用兩樣本t 檢驗，不同組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，P ﹤0.05 認為有統(tǒng)計學意義上差異。

2 結果

2.1 倒置熒光顯微鏡下和流式細胞術檢測腺病毒轉染效率 倒置熒光顯微鏡可觀察到，C6 經(jīng)腺病毒轉染24 h 后，Adv-GFP 組、Adv-rHSG-GFP 組細胞在490 nm 藍色光激發(fā)下有綠色熒光蛋白的強表達;PBS 組并無綠色熒光表達(見圖1A)。

流式細胞儀分析結果顯示，PBS 組作為對照，幾乎沒有細胞檢測到GFP 蛋白的表達，Adv-GFP 組中GFP 陽性細胞占所有細胞的(91.74 ± 1.08)%，Adv-rHSG-GFP 組中GFP 陽性細胞占所有細胞的(96.86 ±1.07)%(見圖1B)。綠色熒光蛋白作為腺病毒轉染細胞后成功表達的標記蛋白(rHSG 與GFP 共表達)，說明C6 細胞自身沒有綠色熒光蛋白表達，腺病毒可以高效地將目的基因導入C6 靶細胞并表達。

2.2 過表達rHSG 蛋白的C6 細胞 Western blot 檢測表明，轉染腺病毒48 h、72 h 后各個分組都有rHSG 蛋白的特異性條帶，但Adv-rHSG-GFP 組較Adv-GFP 組和PBS 組蛋白的特異性條帶明顯增強(P ＜0.01)，Adv-GFP 組和PBS 組之間無顯著差異(P ＞0.05)(見圖2)。說明表明Adv-rHSG-GFP 組C6 細胞rHSG 蛋白過表達，而腺病毒空載對照組經(jīng)Adv-GFP 轉染后，未見rHSG 過表達現(xiàn)象。

2.3 腺病毒轉染后C6 細胞周期分布 流式細胞儀檢測C6 細胞DNA 含量(細胞周期)結果顯示:PBS 組G0/G1 期 細 胞 百 分 率 為(46.05 ±3.15)%，腺病毒轉染48 h 后，Adv-GFP 組和AdvrHSG-GFP 組G0/G1 期細胞百分率分別為(47.56 ±1.87)%、(62.79 ±2.01)%;轉染72 h 后，兩組細胞G0/G1 期 細 胞 百 分 率 分 別 為(47.91 ± 2.50)%、(63.83±1.31)%(見表2、圖3)。PBS 組S 期細胞百分率為(46.05 ±3.15)%，腺病毒轉染48 h 后，Adv-GFP 組和Adv-rHSG-GFP 組S 期細胞百分率分別為(47.56±1.87)%、(62.79±2.01)%;轉染72 h 后，兩組細胞S 期細胞百分率分別為(47.91 ±2.50)%、(63.83 ±1.31)%(見表3、圖3)。說明Adv-rHSGGFP 組的C6 細胞周期受到明顯影響，與PBS 組或Adv-GFP 組相比，各個時間點，Adv-rHSG-GFP 組停滯于G0/G1 期的細胞數(shù)量都明顯增加(P ＜0.01)，C6細胞過表達rHSG 后其周期被明顯阻滯于G0/G1 期，進入S 期的細胞數(shù)量減少(P ＜0.01);而PBS 組與Adv-GFP 組與相比細胞周期無顯著變化(P ＞0.05)。

2.4 H-Ras、K-Ras、N-Ras 基因的mRNA 的表達 qRT-PCR 結果顯示:10 ng/ml 的IGF-1 誘導15 min后，PBS 組、Adv-GFP 組及Adv-rHSG-GFP 組之間H-Ras、K-Ras、N-Ras 基因mRNA 表達量之間并無明顯差異(P ＞0.05)。說明，rHSG 蛋白過表達對C6 細胞的H-Ras、K-Ras、N-Ras 基因的mRNA 表達量并沒有產(chǎn)生明顯影響(結果未顯示)。

2.5 Erk1、Erk2 基因的mRNA 的表達 qRTPCR 結果顯示:10 ng/ml 的IGF-1 誘導15 min 后，PBS 組、Adv-GFP 組及Adv-rHSG-GFP 組之間Erk1、Erk2 基因mRNA 表達量之間并無明顯差異(P ＞0.05)。說明rHSG 蛋白過表達對C6 細胞的Erk1、Erk2 基因的mRNA 表達量并沒有產(chǎn)生明顯影響(結果未顯示)。

2.6 H-Ras、K-Ras、N-Ras 蛋白的表達 Western blot 結果顯示:10 ng/ml 的IGF-1 誘導15 min后，PBS 組、Adv-GFP 組及Adv-rHSG-GFP 組之間H-Ras、K-Ras、N-Ras 蛋白特異性條帶強度之間并無顯著差異(P ＞0.05)(見圖4)。說明rHSG 蛋白過表達對C6 細胞的H-Ras、K-Ras、N-Ras 蛋白表達量并沒有產(chǎn)生明顯影響。

2.7 Erk1/2 蛋白的表達 Western blot 結果顯示:10 ng/ml 的IGF-1 誘導15 min 后，PBS 組、Adv-GFP 組及Adv-rHSG-GFP 組之間非磷酸化Erk1/2蛋白特異性條帶強度之間并無顯著差異(P ＞0.05)(見圖5C)。說明rHSG 蛋白過表達對C6 細胞的Erk1/2 蛋白表達量并沒有產(chǎn)生明顯影響。

2.8 rHSG 過表達對IGF-1 誘導C6 細胞的Erk1/2 磷酸化的影響 Western blot 檢測結果顯示:10 ng/ml 的IGF-1 誘導15 min 后，PBS 組的C6 細胞p-Erk1/2 磷酸化特異性條帶強度明顯強于未使用IGF-1 誘導的C6 細胞(P ＜0.01)(見圖5B)，說明IGF-1 誘導使C6 細胞p-Erk1/2 磷酸化蛋白表達量明顯升高。10 ng/ml 的IGF-1 誘導15 min 后，PBS 組與Adv-GFP 組之間p-Erk1/2 磷酸化蛋白特異性條帶強度相似，無明顯差異(P ＞0.05);Adv-rHSG-GFP 感染組p-Erk1/2 磷酸化蛋白特異性條帶強度均較PBS組及同一時間點Adv-GFP 組明顯減弱(P ＜0.01)(見圖5B)。說明rHSG 蛋白過表達能顯著抑制IGF-1 所誘導的C6 細胞Erk1/2 蛋白磷酸化。

2.9 磷酸化及非磷酸化Rb 蛋白的表達Western blot 檢測結果顯示，未使用IGF-1 誘導的PBS 組與經(jīng)IGF-1 誘導后的PBS 組p-Rb 磷酸化蛋白特異性條帶強度相似，并無明顯差異(P ＞0.05);10 ng/ml 的IGF-1 誘導15min 后，Adv-rHSG-GFP 組p-Rb 磷酸化蛋白特異性條帶均較PBS 組或同一時間點Adv-GFP 組明顯減弱(P ＜0.01)(見圖5D);各組之間非磷酸化Rb 蛋白表達特異性條帶強度相似(P ＞0.05)(見圖5E)。說明rHSG 蛋白過表達能使C6 細胞p-Rb 磷酸化蛋白表達降低。

表1 目的基因引物序列

表2 流式細胞儀檢測C6 細胞G0/G1 期分布(n=3，)

表2 流式細胞儀檢測C6 細胞G0/G1 期分布(n=3，)

與PBS 組比較aP ＜0.01

表3 流式細胞儀檢測C6 細胞S 期分布(n=3，)

表3 流式細胞儀檢測C6 細胞S 期分布(n=3，)

與PBS 組比aP ＜0.01

圖1 倒置熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測GFP 蛋白的表達

圖2 Western blot 檢測經(jīng)重組腺病毒載體轉染后rHSG 的表達

圖3 流式細胞儀檢測各組細胞周期變化

圖4 Western blot 檢測rHSG 過表達后C6 細胞中H-Ras、K-Ras、N-Ras 蛋白的表達

圖5 Western blot 檢測rHSG 過表達后C6 細胞中p-Erk1/2、Erk1/2、p-Rb、Rb 蛋白的表達

3 討論

膠質瘤作為高度惡性的原發(fā)性神經(jīng)上皮腫瘤，被定義為細胞增殖紊亂性疾病，其發(fā)生、發(fā)展和細胞周期調控的異常密切相關。細胞周期是細胞進行生命活動的基本進程，其調控非常精細，細胞周期的調控異常，尤其是G1/S 時相轉換異常是癌變的關鍵點［8］。近年來，rHSG 作為一個潛在的抗腫瘤靶點，其抗腫瘤作用吸引眾多腫瘤研究學者們的廣泛興趣。rHSG 在多種類型惡性腫瘤細胞中的抗增殖作用，包括胃癌細胞系(SGC7901)、肝癌細胞系(HepG2)、膀胱癌細胞(T24、5637)，已得到證實［9～11］。本課題組之前首次證實了rHSG 抗惡性膠質瘤增殖作用［5］，而本實驗通過重組腺病毒載體(Adv-rHSG-GFP)感染大鼠膠質瘤C6 細胞，針對rHSG 的抑癌作用與RASRAF-MEK-ERK 信號通路的聯(lián)系進行了深一步探討。

Ras-Raf-MEK-ERK 信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路中十分經(jīng)典的也是被研究最清楚的一條，在細胞信號傳導、細胞周期調控中扮演著重要的角色［12，13］。目前國內(nèi)外研究已證實，多種細胞因子、生長因子、炎癥因子等細胞外刺激信號，可通過相關的細胞信號傳導路徑，特別是通過激活Ras 原癌基因及其所介導的Ras-Raf-MEK-ERK 信號傳導通路，將胞外刺激信號轉導至胞質及其核內(nèi)，引起腫瘤細胞的過度增殖。當細胞感受到外界絲分裂信號(如IGF-1等)刺激時，Ras-Raf-MEK-ERK 通路被激活，p-Erk1/2磷酸化蛋白表達增加，由胞質轉位到核內(nèi)，導致細胞周期蛋白cyclinD 等合成的增加和具有負向調控細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)活性的p27Kip1 等CKI 蛋白被通過泛素化途徑降解，CDK/cyclin 復合物磷酸化成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白Rb(哺乳動物細胞的G1/S 轉換的主要調節(jié)器)的能力增強，p-Rb 磷酸化蛋白表達增加，非磷酸化Rb 蛋白表達減少，進而釋放出大量的轉錄因子E2F1-3，推動著細胞周期由G1 期進入S 期，開啟細胞周期進程［14～16］;而相反的，非磷酸化的Rb 蛋白能夠與轉錄調節(jié)因子E2F 結合，抑制其轉錄活性，導致G1/S 時相基因無法表達［17，18］。

本實驗研究顯示，rHSG 過表達可以抑制Ras-Raf-MEK-ERK 通路的激活，繼而使p-Rb 蛋白表達的降低，C6 細胞內(nèi)非磷酸化Rb 蛋白積聚，C6 細胞周期停滯在G0/G1 期。說明rHSG 基因過表達抑制C6 細胞增殖的分子機制是通過抑制Ras-Raf-MEK-ERK 通路的激活來介導膠質瘤細胞G0/G1 期細胞周期阻滯，抑制細胞增殖的。此外，H-Ras、K-Ras、N-Ras 基因的轉錄和蛋白表達水平并沒有發(fā)生顯著變化，說明rHSG 蛋白的過表達并不調節(jié)Ras 基因表達變化，而是可能通過其C-末端片段與Ras 相互作用，N 末端與Ras 的下游效應分子Raf-1 相互作用，充當Ras 的效應分子來抑制RAS-RAF-MEK-ERK 信號通路的激活，從而發(fā)揮其抗增殖作用的［19］。這與rHSG 在血管平滑肌細胞［1］、B細胞淋巴瘤BJAB 細胞系、小鼠胚胎成纖維細胞及結腸直腸癌細胞中的作用機制是一致的。

綜上所述，我們認為rHSG 可能通過抑制Ras-Raf-MEK-ERK 信號通路的激活抗C6 惡性膠質瘤細胞增殖。本實驗探討了rHSG 的抑癌作用與Ras-Raf-MEK-ERK 信號通路的聯(lián)系，既是對rHSG 抗膠質瘤增殖機制的進一步研究探討，又可以為后續(xù)研究以及其他相關研究提供了實驗室依據(jù)。rHSG 對大鼠膠質瘤細胞凋亡、遷移和細胞外基質成分的改變及其作用機制至今未研究清楚，還需進一步的研究。

［1］Chen GH，Liu NK，Zhou AR，et al.The role of hypertension-related gene in aortic vascular smooth muscle cells from mice and rats［J］.Chin Med J，2001，114(8):833-836.

［2］Chen KH，Guo XM，，Li Q，et al.Dysregulation of HSG triggers vascular proliferative disorderrs［J］.Nature Cell Biology，2004，6:872-883.

［3］Wang WL，Lu JJ，Zhu F，et al.Pro-apoptotic and anti-proliferative effects of mitofusin-2 via Bax signaling in hepatocellular carcinoma cells［J］.Med Oncol，2010，29:70-76.

［4］Jin BY，F(xiàn)u GH，Pan H，et al.Anti-tumourefficacy of mitofusin-2 in urinary bladder carcinoma［J］.Med Oncol，2010，28:373-380.

［5］Gao P，Wang Z，Zhang B，et al.Suppression of C6 gliomas via application of rat hyperplasia gene［J］.The International Journal of Biological Markers，2014，29(4):e411-422.

［6］高 鵬，蔣樹財，郭 暉，等.大鼠增殖抑制基因抑制大鼠膠質瘤細胞的增殖及其機制［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2014，4:381-385.

［7］Chumsri S，Howes T，Bao T，et al.Aromatase，aromatase inhibitors，and breast cancer［J］.J Steroid Biochem Mol Biol，2011，125(1/2):13-22.

［8］Massague J.G1 cell-cycle control and cancer［J］.Nature，2004，432(7015):298-306.

［9］Zhang GE，Jin HL，Lin XK，et al.Anti-Tumor effects of mfn2 in gastric cancer［J］.International Journal of Molecular Sciences，2013，14(7):13005-13021.

［10］W Wang，J Lu，F(xiàn) Zhu，et al.Pro-apoptotic and anti-proliferative effects of mitofusin-2 via Bax signaling in hepatocellular carcinoma cells［J］.Medical Oncology，2012，29(1):70-76.

［11］Jin B，F(xiàn)u G，Pan H，et al.Anti-tumour efficacy of mitofusin-2 in urinary bladder carcinoma［J］.Medical Oncology，2011，28:373-380.

［12］Raman M，Chen W，Cobb MH.Differential regulation and properties of MAPKs［J］.Oncogene，2007，26(22):3100-3112.

［13］Coleman ML，Marshall CJ，Olson MF.Ras and Rho GTPases in G1-phase cell cycle regulation［J］.Nature Rev Mol Cell Biol，2004，5(5):355-366.

［14］Delmas C，Manenti S，Boudjelal A，et al.The p42/p44 mitogen-activated protein kinase activation triggers p27kip1 degradation independently of cdk2/cyclin E in NIH 3T3 cells［J］.J Biol Chem，2001，276:34958-34965.

［15］Leone G，DeGregori J，Sears R，et al.Myc and Ras collaborate in inducing accumulation of active cyclin E/Cdk2 and E2F［J］.Nature，1997，387:422-426 .

［16］Aktas H，Cai H，Cooper GM.Ras links growth factor signaling to the cell cycle machinery via regulation of cyclin D1 and the Cdk inhibitor p27KIP1［J］.Mol Cell Biol，1997，17:3850-3857.

［17］Macleod KF.The role of the RB tumour suppressor pathway in oxidative stress responses in the haematopoietic system ［J］.Nature Reviews Cancer，2008，8(10):769-781.

［18］Chau BN，Wang JY.Coordinated regulation of life and death by RB［J］.Nature Reviews Cancer，2003，3(2):130-138.

［19］Chen KH，Dasgupta A，Ding J，et al.Role of mitofusin 2 (Mfn2)in controlling cellular proliferation［J］.J FASEB，2014，28(1):382-394.