豬頸總動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄動(dòng)物模型的建立及PPAR-γ與PI3K/Akt 和NF-кB 的表達(dá)變化

鄭 波，楊源潤(rùn)，周振華，劉 渠，陳康寧

頸動(dòng)脈支架植入治療作為一種微創(chuàng)、安全有效的方法，顯著降低卒中的復(fù)發(fā)及改善卒中的預(yù)后。但頸動(dòng)脈支架植入術(shù)后支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生率約占2%～30%［1，2］，支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生嚴(yán)重影響支架植入術(shù)后的遠(yuǎn)期療效，而且再狹窄的發(fā)生機(jī)制尚未明確。

關(guān)于支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生機(jī)制，目前研究認(rèn)為血管內(nèi)皮的損傷可能是支架內(nèi)再狹窄的始動(dòng)因素［3］，由于內(nèi)皮損傷大量炎癥介質(zhì)的釋放，可能激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-кB(nuclear factor-кB，NF-кB)和PI3K/Akt(phosphatidyl Inositol 3-kinase/protein kinase b)的表達(dá)，從而促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移及局部炎性反應(yīng)，并通過復(fù)雜病理生理過程導(dǎo)致支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生［4，5］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ)屬于核受體超家族成員，其作用功能非常廣泛［6，7］。本研究擬探索PPAR-γ 與支架內(nèi)再狹窄的相關(guān)性。

由于豬頸總動(dòng)脈支架植入術(shù)后再狹窄與人類頸動(dòng)脈支架植入術(shù)后再狹窄在組織病理學(xué)變化方面基本相同，因此，本實(shí)驗(yàn)采用豬股動(dòng)脈暴露、頸總動(dòng)脈球囊擴(kuò)張及支架釋放的方法建立豬頸總動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄動(dòng)脈模型，初步探討支架段血管PPAR-γ 與PI3K/Akt 及NF-кB 的表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用巴馬小香豬10 只，雌雄不限，月齡3～4 m，平均體重(19.2 ±1.4)kg，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。分為正常對(duì)照組(n=5)和支架植入組(n=5)，在普通環(huán)境中喂養(yǎng)，自由飲水。

1.1.2 主要藥物和試劑 阿司匹林腸溶片、硫酸氫氯吡格雷片、阿托品注射液、速眠新注射液、3%戊巴比妥鈉、碘海醇注射液(歐乃派克)、鼠抗豬單克隆NF-кB p65 抗體(GTX13594，GeneTex)、兔抗豬多克隆PPARG 抗體(AHP1461，abd serotec)、兔抗豬多克隆beta Actin 抗體(GTX16039，GeneTex)、兔抗豬多克隆Phospho-Akt (Ser473)和Akt 抗體(Cell Signiling，9271 和9272)。

1.1.3 主要器械和儀器 眼科剪、彎止血鉗、手術(shù)刀、5F 及8F RADIFOCUS INTRODUCER∥(RS＊A50K10SQ，TERUMO)、泥鰍導(dǎo)絲(0.035’，Cordis)、5F 造影導(dǎo)管及8F 導(dǎo)引導(dǎo)管(Cordis)、4 mm ×18 mm 金屬裸支架(Apollo，Microport)、2 mm×9 mm球囊(gateway，stryker)、4 mm×20 mm 球囊(Apollo，Microport)、數(shù)字減影血管造影機(jī)(DSA)(Artis floor，SIEMENS)、化學(xué)發(fā)光成像儀(IS4000MM)。

1.1.4 動(dòng)物倫理 實(shí)驗(yàn)過程符合動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定，并得到第三軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 麻醉方法 術(shù)前禁食，肌注0.5 mg 阿托品，以0.1 ml/kg 速眠新肌注誘導(dǎo)麻醉，靜脈輸液針(0.7 ×22.5TWLB)沿耳緣靜脈建立通道并固定封管，3%戊巴比妥鈉以0.3 ml/kg 靜脈推注［8］，觀察生命體征及反應(yīng)，可少量多次追加麻醉。

1.2.2 股動(dòng)脈分離 將豬仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，暴露右側(cè)腹股溝，備皮后常規(guī)消毒、鋪巾，逐層切開皮膚及皮下組織，暴露、游離股動(dòng)脈約2 cm，將1 號(hào)絲線置于股動(dòng)脈近心端及遠(yuǎn)心端，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，穿刺針穿刺置鞘，置鞘成功后縫合固定動(dòng)脈鞘。

1.2.3 豬頸總動(dòng)脈支架植入 術(shù)前3 d 喂養(yǎng)阿斯匹林100 mg/d 和氯吡格雷75 mg/d，置鞘成功后靜推肝素2000 U。肝素生理鹽水潤(rùn)濕器械，將金屬裸支架置于4 mm ×20 mm 球囊上備用。沿泥鰍導(dǎo)絲將8F 導(dǎo)引導(dǎo)管送至豬頸總動(dòng)脈近端，將帶支架的球囊送至頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)端，以1.1～1.2∶ 1 的比例在16 atm 持續(xù)30 s 下釋放支架，間隔60 s 后重復(fù)擴(kuò)張一次，造影確認(rèn)無(wú)嚴(yán)重內(nèi)膜撕裂和血栓形成，且遠(yuǎn)端血管顯影良好后退出導(dǎo)管及動(dòng)脈鞘，結(jié)扎股動(dòng)脈，縫合切口。正常對(duì)照組給予暴露股動(dòng)脈、置鞘、結(jié)扎及縫合切口處理。術(shù)后3 d 均給予480 萬(wàn)青霉素鈉抗感染，同時(shí)給予阿司匹林100 mg/d、氯吡格雷75 mg/d抗血小板聚集，直至動(dòng)物處死。

1.2.4 血管造影及標(biāo)本采集 術(shù)后3 m，行血管造影觀察支架段血管情況。造影結(jié)束后，靜推氯化鉀處死動(dòng)物，采取頸總動(dòng)脈支架段及臨近5 mm的血管標(biāo)本，一部分放入4%多聚甲醛中，另一部分放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 病理形態(tài)學(xué)檢查 將4%多聚甲醛固定的標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋切片，行HE 染色。在4 倍物鏡下將完整的血管橫切面HE 染色圖像攝入計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)中進(jìn)行圖像編輯，逐步測(cè)算血管管腔面積、內(nèi)彈力膜面積、新生內(nèi)膜面積及管腔狹窄百分比。其中新生內(nèi)膜面積=內(nèi)彈力膜面積-管腔面積，管腔狹窄百分比=［1 -(管腔面積/內(nèi)彈力膜面積)］×100%。

1.2.6 免 疫 組 化 染 色 檢 測(cè)NF-кB、P-Akt、PPAR-γ 標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、切片，用SP 法檢測(cè)NFкB、P-Akt、PPAR-γ 的表達(dá)，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染。采用半定量積分法對(duì)切片結(jié)果進(jìn)行分析:每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)高倍鏡視野(×400)，分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞后根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率讀片，陽(yáng)性細(xì)胞分級(jí)＜25%為1 分;26%～50%為2 分;51%～75%為3分;＞75%為4 分。根據(jù)染色強(qiáng)度讀片:無(wú)色為0分;淡棕色1 分;染色介于1 分與3 分之間為2 分;棕褐色3 分。兩種評(píng)分相乘并取5 個(gè)高倍視野的平均值為最終評(píng)分:陰性(＜1)、弱陽(yáng)性(2～4)、陽(yáng)性(5～8)、強(qiáng)陽(yáng)性(＞9)，＞2 分為陽(yáng)性結(jié)果。

1.2.7 Western blot 印跡檢測(cè)NF-кB、P-Akt、Akt、PPAR-γ 取出液氮中保存的標(biāo)本提取蛋白，并采用BCA 法測(cè)量蛋白濃度，6%的SDS-PAGE 電泳約1.5 h，并電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，37 ℃封閉液封閉1.5 h;分別加入一抗于4 ℃孵育過夜;TBST 洗膜，二抗(1∶ 2 000 稀釋)37 ℃孵育1.5 h;TBST 洗膜，ECL 法顯影，用ImageJ 圖像分析系統(tǒng)分析圖像，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin 蛋白條帶灰度值的比值表示相對(duì)蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 建立豬頸總動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄動(dòng)物模型術(shù)后3 m，DSA 檢查可見支架植入組頸總動(dòng)脈支架植入段管腔明顯變細(xì)(見圖1)，HE 染色可見支架植入組標(biāo)本明顯內(nèi)膜增生、管腔狹窄(見圖2)。將HE 染色圖像攝入計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像編輯，可見兩組內(nèi)彈力膜面積相仿，而支架植入組血管管腔面積明顯低于正常對(duì)照組、新生內(nèi)膜面積和管腔狹窄百分比明顯高于正常對(duì)照組，兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

2.2 支架植入組支架段PPAR-γ 的表達(dá)變化采用Western blot 印跡法結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，支架植入組支架段PPAR-γ 表達(dá)明顯下降(0.4953 ±0.0498 vs 0.1782 ±0.0586，P ＜0.05，見圖3);免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，支架植入組支架段標(biāo)本棕褐色或棕黃色著色的陽(yáng)性細(xì)胞明顯少于對(duì)照組(7.200 ±0.4899 vs 2.400 ±0.2449，P ＜0.05，見圖4)。

2.3 支架植入組支架段NF-кB 和P-Akt 的表達(dá)變化 采用Western blot 印跡法和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)頸總動(dòng)脈NF-кB、P-Akt 及Akt 的表達(dá)變化。術(shù)后3 m，與正常對(duì)照組相比，支架植入組支架段組織NF-кB 和P-Akt 表達(dá)明顯上調(diào)(0.0436 ±0.0298 vs 0.4185 ±0.0519;0.2926 ±0.0448 vs 0.3367 ±0.0512，P ＜0.05，見 圖3)，Akt 表 達(dá) 兩 組 相 仿(0.3238 ±0.0370 vs 0.3645 ±0.0422，P ＞0.05，見圖3)。術(shù)后3 m，正常對(duì)照組頸動(dòng)脈血管壁NF-κB幾乎不表達(dá)，而支架植入組NF-κB 的表達(dá)明顯增高，達(dá)4.63±0.52(P ＜0.05，見圖4);術(shù)后3 m，正常對(duì)照組P-akt 表達(dá)為0.88 ±0.64，而支架植入組P-akt 表達(dá)明顯增加達(dá)4.63±0.52(P ＜0.05，見圖4)。

表1 正常對(duì)照組和支架植入組血管面積值(n=5，)

表1 正常對(duì)照組和支架植入組血管面積值(n=5，)

圖1 豬頸總動(dòng)脈狹窄(3 m 后血管造影)。箭頭所示支架段血管狹窄

圖2 豬頸總動(dòng)脈內(nèi)膜增生(HE 染色100 ×)。A 代表內(nèi)膜B 代表中膜;C 代表外膜

圖3 豬頸總動(dòng)脈PPAR-γ、NF-кB、P-Akt 及Akt 的表達(dá)(Western blot 印跡)。與正常對(duì)照組相比，NF-кB 和P-Akt 表達(dá)明顯增加(P ＜0.05)，PPAR-γ 表達(dá)明顯下調(diào)(P ＜0.05)，Akt 表達(dá)兩組相仿(P ＞0.05)。A 代表正常對(duì)照組，B 代表支架植入組。圖4 豬頸總動(dòng)脈PPARgamma、NF-кB、p-akt 的免疫組化染色。與正常對(duì)照組相比，NF-кB 和p-akt 表達(dá)明顯上調(diào)(P ＜0.05)，而PPAR-γ 表達(dá)明顯下調(diào)(P ＜0.05)

3 討論

3.1 豬頸總動(dòng)脈支架植入再狹窄動(dòng)物模型的建立 通過股動(dòng)脈穿刺、頸總動(dòng)脈球囊擴(kuò)張及支架植入的方法行豬頸總動(dòng)脈支架植入術(shù)，術(shù)后3 mDSA 造影可見支架內(nèi)再狹窄形成，同時(shí)HE 染色行圖像編輯結(jié)果顯示支架植入組管腔面積再狹窄率達(dá)(23.65 ±6.35)%，進(jìn)一步證實(shí)豬頸總動(dòng)脈支架植入再狹窄動(dòng)物模型的成功建立。對(duì)于支架內(nèi)再狹窄動(dòng)物模型的建立，既往通常采用球囊過度擴(kuò)張(擴(kuò)張比例為1.2～1.3∶ 1)、動(dòng)脈內(nèi)膜拉傷及輔以高脂高膽固醇飲食等方式［9］，這些方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用，其組織病理學(xué)表現(xiàn)與人類再狹窄結(jié)果十分相似，但與常規(guī)人類頸動(dòng)脈狹窄的管理及治療具有很大差異。本實(shí)驗(yàn)通過模擬人類頸動(dòng)脈狹窄支架植入的操作方式及注意事項(xiàng)，并控制相關(guān)危險(xiǎn)因素的前提下建立豬頸總動(dòng)脈支架植入后再狹窄動(dòng)物模型。我們的模型更加符合臨床研究需要，為下一步探索再狹窄機(jī)制提供依據(jù)。

3.2 手術(shù)操作的注意事項(xiàng)及與既往再狹窄研究的異同 既往通常采用球囊過度擴(kuò)張及支架釋放建立支架內(nèi)再狹窄模型，通過比較再狹窄的程度來(lái)確定不同支架類型(如金屬裸支架、藥物支架或自膨式支架、球擴(kuò)式支架等)在防止再狹窄中的優(yōu)勢(shì)［10］。目前對(duì)于支架內(nèi)再狹窄治療研究較多的是藥物涂層支架和血管內(nèi)放射，但是其遠(yuǎn)期療效并不優(yōu)于金屬裸支架。本實(shí)驗(yàn)組以更加貼近臨床的方式建立支架內(nèi)再狹窄模型，決定從支架植入后血管的病理生理改變進(jìn)行研究，通過對(duì)血管病理生理機(jī)制的探索來(lái)預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生。

3.3 頸總動(dòng)脈支架植入術(shù)后3 mPPAR-γ、NFкB 及PI3K/Akt 的表達(dá)變化 PPAR-γ 是由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，作用廣泛，具有抗炎、調(diào)節(jié)糖脂代謝及血管保護(hù)等功能［6，7］。然而，關(guān)于PPARγ 在頸動(dòng)脈支架植入術(shù)后再狹窄機(jī)制中的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)支架植入術(shù)后3 m 支架組PPARγ的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯降低，同時(shí)支架植入組支架內(nèi)再狹窄明顯增加。因此，我們推測(cè)支架植入后下調(diào)PPAR-γ 的表達(dá)，從而降低了PPAR-γ 抗炎及血管保護(hù)等功能，從而導(dǎo)致了支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生。

支架釋放時(shí)內(nèi)膜損傷產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)及支架異物刺激等因素促進(jìn)了NF-кB 的表達(dá)，可能通過各種病理生理過程導(dǎo)致支架內(nèi)新生內(nèi)膜的形成及支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生［4］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)支架植入組術(shù)后NF-кB 的表達(dá)明顯增加，伴有明顯的支架內(nèi)再狹窄，進(jìn)一步證實(shí)支架植入后通過上調(diào)NF-кB 的表達(dá)，從而加重支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生。

在血管平滑肌細(xì)胞中，血管平滑肌增殖遷移的基礎(chǔ)是PI3K/AKT 通路的激活［11］。我們研究發(fā)現(xiàn):支架植入術(shù)后3 m，支架組P-Akt 蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯增加(P ＜0.05)，Akt 蛋白表達(dá)量在兩組中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們認(rèn)為支架植入后血管病理生理學(xué)改變通過激活PI3K/AKT 通路促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖遷移，從而加重支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生。

3.4 支架植入術(shù)后NF-кB、PI3K/Akt、PPAR-γ的表達(dá)變化與支架內(nèi)再狹窄之間的關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)研究得知，豬頸總動(dòng)脈支架植入術(shù)后3 m，NF-кB 和p-Akt 表達(dá)明顯增加，而PPAR-γ 表達(dá)明顯下調(diào)。我們推測(cè):支架植入術(shù)后PPAR-γ 表達(dá)下調(diào)，對(duì)血管炎性反應(yīng)、血管平滑肌細(xì)胞增殖遷移及內(nèi)膜增生等抑制作用減弱，從而加重支架內(nèi)再狹窄的發(fā)生。目前，關(guān)于PPAR-γ 調(diào)控支架內(nèi)再狹窄的具體機(jī)制尚不明確，通過對(duì)豬頸總動(dòng)脈支架內(nèi)再狹窄模型的研究，明確金屬裸支架植入后頸總動(dòng)脈均發(fā)生了支架內(nèi)再狹窄。在此前提下，我們可以建立兩組動(dòng)物模型:支架植入后，一組口服PPAR-γ 激動(dòng)劑;另一組使用安慰劑，術(shù)后3 m 評(píng)估血管情況及提取標(biāo)本行進(jìn)一步研究，從而探索PPAR-γ 調(diào)控支架內(nèi)再狹窄的具體機(jī)制，進(jìn)而為臨床治療提供理論依據(jù)。

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