RNF213 基因多態性與廣西壯族成人煙霧病遺傳易感性研究

黃燕蘭，程道賓，張皆德，肖友生，羅 曼

煙霧病(Moyamoya disease，MMD)又稱腦底異常血管網病，是一種病因不明的慢性進行性腦血管狹窄或閉塞性疾病，該病以雙側頸內動脈末端、大腦中動脈和大腦前動脈的起始段進行性狹窄，伴側枝循環形成煙霧樣血管為主要特點［1，2］。流行病學資料表明，煙霧病存在顯著種族和地區差異，該病主要集中在日本、韓國、中國等東亞國家，而西方國家的發病率則相對較低［3］。日本的研究顯示煙霧病患者中12.1%～14.9%有家族史［4，5］，此外，煙霧病患者后代罹患煙霧病的風險較一般人群高，同卵雙胞胎存在較高的發病率［6］，這都表明遺傳因素在煙霧病的發病過程中起了重要作用。

目前普遍認為環指蛋白213(RNF213)基因是研究煙霧病遺傳易感性的主要候選基因［7，8］，然而在高加索煙霧病患者中，并沒有發現相關單核苷酸多態性位點［9］。在王筱萌等［10］的研究中，64 例漢族煙霧病患者中有3 例發生rs138130613 位點的變異。雖然rs138130613 位點的基因型和等位基因頻率在兩組間差異無統計學意義，但仍提示該位點的變異，可能與中國人的煙霧病患病相關。來自廣東省的中國漢族人群的研究顯示，在校正了年齡、家族史、高血壓、糖尿病、吸煙等混雜因素后，顯性模型下rs138130613 位點與非煙霧病的ICASO 具有相關性，提示TT 與CT 基因型攜帶者非煙霧病的ICASO的患病風險較高［11］。國內關于煙霧病的研究對象主要為中國漢族人群，故本研究以廣西壯族成人型煙霧病為研究對象，探討RNF213 基因rs112735431、rs138130613 和rs148731719 位點的多態性與煙霧病的發病及其臨床特征之間的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集來自廣西醫科大學第一附屬醫院2013 年10 月-2015 年5 月符合煙霧病診斷的壯族患者52 例，其中男性28 例(53.8%)，女性24 例(46.2%)，平均(41.6 ±11.2)歲。診斷標準參照日本最新修訂的煙霧病診療指南［12］。選取年齡和性別與煙霧病患者匹配的80 名健康體檢者作為對照組，其中男性42 例(52.5%)，女性38 例(47.5%)，平均(40 ±10.4)歲。同時選取64 例不滿足煙霧病診斷的顱內主干動脈狹窄患者(non-MMD ICASO-intracranial major artery stenosis/occlusion)與對照組做比較，其中男性36 例(56.3%)，女性28 例(43.7%)，平均(42.5 ±12.2)歲。non-MMD ICASO 根據MRA 或CTA 或DSA 影像學診斷。3 組中所有研究對象經詢問確定廣西壯族成年人群。以問卷調查和病歷記錄方法收集所有研究對象的年齡、性別、民族和相關臨床資料。本研究經廣西醫科大學第一附屬醫院倫理委員會認可，所有參加者簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA 提取 采集所有患者及對照者外周靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸抗凝，參照Ezup 柱式血液基因組DNA 抽提試劑盒說明書的操作步驟進行DNA 提取，置-20℃凍存備用。

1.2.2 PCR 檢測 委托上海生工生物工程技術服務公司設計并合成引物(見表1)。PCR 反應體系為40 μl，其中含1.0 μl 的DNA 模板，Mix 溶液20 μl，上下游引物(濃度10 μmol)各1.0 μl，最后加無酶水17 μl。PCR 擴增條件:95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環后72 ℃再延伸6 min。最后上ABI3130 測序儀，收集到的數據用Chromas 軟件進行分析。

表1 各基因位點擴增引物序列

1.2.3 統計學分析 采用SPSS 16.0 軟件進行統計分析，分類變量采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法，以比值比(odds ratio，OR)和95% 可信區間(confidence interval，CI)表示各基因型及等位基因相對危險度。Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)平衡檢驗采用χ2擬合優度檢驗計算。統計學檢驗均以雙側P ＜0.05 代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料分析 煙霧病組、non-MMD ICASO 和正常對照組間性別、年齡差異無統計學意義，表明3 組研究對象中性別、年齡相匹配，資料具有可比性。煙霧病組中缺血型26 例(50.0%)，出血型21 例(40.4%)，TIA 患者5 例(9.6%)。non-MMD ICASO 組缺血型44 例(68.8%)，出血型9 例(14.1%)，TIA 患者11 例(18.0%)。

2.2 Hardy-Weinberg equilibrium(HWE)檢驗對煙霧病、non-MMD ICASO 組和對照組的RNF213 基因rs112735431、rs138130613 和rs148731719 位點的基因型分布進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗，P 值均大于0.05，確認3 組研究樣本是達到遺傳平衡的群體。

2.3 各位點基因型及等位基因頻率在3 組間的比較 rs112735431 位點A 等位基因在煙霧病組與正常對照組、non-MMD ICASO 組與正常對照組間分布頻率差異有統計學意義，進一步構建顯性遺傳模型分析發現，攜帶GA 或AA 基因型比攜帶GG 基因型的人發生煙霧病和顱內主干動脈狹窄的危險性增加(分別為OR=12.29，95%CI 1.47～103.10，P=0.006，OR=8.17，95% CI 0.96～69.74，P=0.045)。rs138130613 和rs148731719 位點等位基因及基因型在煙霧病組和non-MMD ICASO 組分別與正常對照組比較分布頻率差異無統計學意義(見表3)。

表3 3 組間RNF213 基因rs112735431、rs138130613 和rs148731719 位點基因型及等位基因頻率的比較

3 討論

RNF213 基因編碼一種含有5256 個氨基酸的環指蛋白，含有一個鋅指結構，可能類似E3 泛素連接酶的作用，參與體內泛素化過程，從而影響細胞內轉錄調控、信號傳導、炎癥、凋亡等生命活動［13］。動物實驗發現，敲除RNF213 基因的斑馬魚的頭部血管出現嚴重異常，表明RNF213 基因參與形成顱內血管生成過程［8］。一項體外試驗結果發現，在不給予β-干擾素的內皮細胞中 RNF213 R4810K(rs112735431)過表達能夠降低血管再生，而野生型RNF213 的內皮細胞則不能。進一步動物實驗證明，RNF213 R4810K 的多態性和炎癥信號、環境因素在腦血管缺氧機制中有重要作用［14］。Kamada 等［7］的動物實驗發現，RNF213 主要表達于小鼠的脾臟及粒細胞等成熟的免疫組織中，而脾池是內皮祖細胞募集分化為成熟內皮細胞的主要場所，參與脈管系統的形成。由此推測，RNF213 基因的多態性可能通過影響環指蛋白在脾臟中的表達，改變內皮祖細胞的募集和分化，從而影響血管的再生，但其機制仍不清楚。

我們的研究發現，RNF213 基因rs112735431 位點多態性與廣西壯族成人煙霧病及非煙霧病的顱內主干動脈狹窄相關，提示著一大部分non-MMD ICASO 患者與煙霧病有著相同的遺傳變異，一些不明原因的ICASO 可能是煙霧病前期。rs138130613及rs148731719 位點基因頻率和基因型與正常人群比較差異無統計學意義，提示 RNF213 基因rs138130613 位點多態性在廣西壯族人群煙霧病發病的遺傳因素中可能不起重要作用。這一結果與前人 的 研 究 結果 相 似［10，15］。另 幾 項 研 究 結果 發現［9，16，17］，不同種族和不同地區間RNF213 基因多態性位點的基因型及等位基因攜帶頻率均存在顯著差異，說明RNF213 基因多態性對不同種族人群的煙霧病易感性的影響不同，提示著東方和西方國家煙霧病患者可能有著不同的疾病特點。以上結果說明雖然存在種族差異及遺傳背景不同，RNF213 基因的多態性在不同種族特別是亞洲人群煙霧病的遺傳因素中均有重要影響。這種多態性究竟是與其致病或易感基因連鎖，還是它通過或協同其他基因發揮作用或其本身單獨發揮作用有待進一步研究，雖然Wang X 等［15］的研究并未發現在煙霧病患者中存在顯著基因-基因交互作用。

本研究樣本量少，缺乏對患者的長期隨訪，無法評估患者的預后。仍需要大樣本量的病例對照研究或基于家族設計的研究來闡明RNF213 基因的多態性與煙霧病的發病、病程、疾病特點及預后之間的關系，其對煙霧病的活動性和家庭成員危險性的評估及對疾病藥物治療還是外科手術治療的取決都具有重要意義。

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