中藥異位寧對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠Bcl-2、Fas、Caspase-3信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響

孫可豐，李娜，時(shí)思毛，趙顏，楊德芳，馮曉玲

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EM，簡(jiǎn)稱(chēng)內(nèi)異癥)多發(fā)于育齡期女性，臨床表現(xiàn)以痛經(jīng)、下腹痛和性交痛為主，其發(fā)病率逐年上升，近幾年可達(dá)10%～15%，占普通婦科手術(shù)的30%以上。近年來(lái)，內(nèi)異癥引起的不孕癥也成為了研究熱點(diǎn)之一，嚴(yán)重地影響了婦女的生活質(zhì)量及身心健康。無(wú)生育要求的內(nèi)異癥患者以減滅和消除病灶，減輕和消除疼痛，減少和避免復(fù)發(fā)為主要治療原則［1-2］。鑒于內(nèi)異癥的手術(shù)治療效果不甚理想，術(shù)后又易于復(fù)發(fā)，有生育要求患者應(yīng)謹(jǐn)慎選擇手術(shù)治療，因此，藥物治療仍占重要地位［3］。本研究通過(guò)探討中藥復(fù)方異位寧對(duì)Bcl-2、Fas、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響來(lái)闡述異位寧治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用機(jī)制，為其推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar雌性大鼠，8～12周齡，未孕，體質(zhì)量(200±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，微生物控制等級(jí)一級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

中藥復(fù)方異位寧:赤芍15g，金銀花20g，延胡索20g，莪術(shù)10g，蜈蚣1條，牡蠣15g，薏苡仁15g，柴胡20g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)門(mén)診藥局統(tǒng)一煎制提供。達(dá)那唑:200mg/粒，江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20010101。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

大鼠Bcl-2、Fas、Caspase-3蛋白檢測(cè)試劑盒及免疫組化染色試劑盒，均由武漢博士德生物工程公司提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 EM 大鼠模型制備方法

乙烯雌酚0.2mg/只皮下注射促情，麻醉后無(wú)菌條件下開(kāi)腹，分離并結(jié)扎右側(cè)子宮，取中段2cm，縱形剪開(kāi)，剝離宮內(nèi)膜，剪成等大3塊，分別縫合于子宮交叉處、左側(cè)卵巢、左側(cè)腹膜壁層，術(shù)畢，關(guān)腹。每只大鼠術(shù)后每日腹腔注射慶大霉素0.1ml，共3天。

2.2 分組及給藥

模型制備后正常飼養(yǎng)1個(gè)月，隨機(jī)分為五組，異位寧高劑量組(n=10)每日5.4g/100g異位寧灌胃;異位寧低劑量組(n=10)每日1.8g/100g異位寧灌胃;西藥組(n=11)，每日3.6g/100g達(dá)那唑混懸液灌胃;正常對(duì)照組(n=11)不予任何處理;模型組(n=9)每日以等量生理鹽水灌胃;五組大鼠均灌胃1個(gè)月。

2.3 切片及染色、Western-Blot

灌胃結(jié)束后，大鼠眶后取血，斷髓處死，解剖獲取大鼠正常對(duì)照組在位子宮內(nèi)膜，及其余各組大鼠子宮交叉處的異位子宮內(nèi)膜，常規(guī)石蠟包埋，切片，采用免疫組化法，常規(guī)處理后顯微鏡觀察。Western-Blot法:提取獲得組織之蛋白，按照蛋白印跡實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格操作。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)造模結(jié)果

造模術(shù)后飼養(yǎng)1個(gè)月，隨機(jī)抽取8只大鼠二次開(kāi)腹。可見(jiàn):移植宮內(nèi)膜體積增大，部分增大物內(nèi)含液性物體;或由結(jié)締組織包裹，腹壁、大網(wǎng)、腸管廣泛粘連，說(shuō)明動(dòng)物模型制備成功。

3.2 HE染色光鏡下觀察結(jié)果

由圖1可見(jiàn)，異位寧高劑量組:在位內(nèi)膜組織形態(tài)無(wú)顯著變化，腺體結(jié)構(gòu)完整，腺上皮排列緊密、整齊，異位內(nèi)膜組織腺體數(shù)目減少、腺腔萎縮，血管數(shù)目減少，腺腔內(nèi)無(wú)炎性滲出物蓄積，間質(zhì)細(xì)胞細(xì)小而稀疏。

異位寧低劑量組:在位內(nèi)膜組織腺腔形態(tài)無(wú)明顯改變，異位內(nèi)膜腺體數(shù)目減少，腺腔變小，腺上皮萎縮。間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、體積均減小。

空白組:正常在位子宮內(nèi)膜厚度如常，腺體數(shù)量如常，分布均勻，間質(zhì)細(xì)胞大小如常、分布均勻、腺體完整，腺上皮細(xì)胞排列整齊，高柱狀，可見(jiàn)核下空泡和頂漿分泌。

模型組:異位內(nèi)膜呈鋸齒封閉式結(jié)構(gòu)或子宮腔狀，腺體數(shù)目較正常組明顯減少，間質(zhì)細(xì)胞較細(xì)長(zhǎng)，內(nèi)含豐富血管，腺上皮細(xì)胞增生，有少數(shù)腺體擴(kuò)散，腔內(nèi)蓄有炎性滲出物，周?chē)w維增生包裹。

3.3 各組大鼠內(nèi)膜Bcl-2、Fas、Caspase-3表達(dá)

3.3.1 免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞比例行半定量判定。陽(yáng)性染色:細(xì)胞漿內(nèi)見(jiàn)棕黃色顆粒染色，即判定為陽(yáng)性，染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn):0分為陰性;強(qiáng)于陰性但染色弱者1分;中等強(qiáng)度染色2分;強(qiáng)染色3分。染色陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)定標(biāo)準(zhǔn):陰性0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%;弱陽(yáng)性1分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～25%;陽(yáng)性2分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為26%～50%;強(qiáng)陽(yáng)性3分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為51%～75%;非常強(qiáng)陽(yáng)性4分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)75%以上。其陽(yáng)性積分為二者評(píng)分相加。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:模型組Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)較正常組增高，有顯著性差異(P＜0.01);高、低劑量組與模型組相比(P＜0.01)，說(shuō)明異位寧能夠降低Bcl-2表達(dá);西藥組(達(dá)那唑組)與模型組相比(P＜0.01)，說(shuō)明異位寧高、低劑量組可降低Bcl-2的表達(dá)，療效較達(dá)那唑組顯著，有極顯著性差異(P＜0.01)，說(shuō)明中藥異位寧在降低Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)方面較西藥達(dá)那唑療效顯著。

模型組Fas、Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)增高，與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01);高、低劑量組與模型組相比(P＜0.01)，異位寧可升高Fas、Caspase-3陽(yáng)性率的表達(dá)。西藥組(達(dá)那唑組)與模型組相比(P＜0.01)，亦可能激活Fas、Caspase-3的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 HE染色光鏡下觀察結(jié)果

表1 各組大鼠內(nèi)膜組織中Bcl-2、Fas、Caspase-3表達(dá)()

表1 各組大鼠內(nèi)膜組織中Bcl-2、Fas、Caspase-3表達(dá)()

注:與正常組相比，#P＜0.01;與模型組相比，*P＜0.01;與西藥組相比，▲P＜0.01。

組別n Bcl-2 Fas Caspase-3正常組11 1.54±0.76 1.36±0.84 1.44±0.84模型組 9 5.10±1.46#▲ 2.26±1.12＊▲ 2.14±1.28*▲異位寧高劑量組10 2.06±1.32＊▲ 5.07±1.26#▲ 5.12±1.38#▲異位寧低劑量組10 2.43±1.34＊▲ 3.01±1.23＊▲ 3.10±1.15＊▲西藥組 11 3.11±1.13* 2.23±1.44* 2.38±1.42*

3.3.2 Western-Blot結(jié)果

各組大鼠內(nèi)膜組織中Bcl-2、Fas、Caspase-3蛋白印記表達(dá)結(jié)果顯示(見(jiàn)圖2)，異位寧高劑量組及低劑量組兩組與模型組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)量均顯著降低(P＜0.01)，而Fas、Caspase-3蛋白表達(dá)量則增高(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，異位寧能夠降低Bcl-2表達(dá)，增加Fas、Caspase-3表達(dá)，促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡能力，限制于宮腔外種殖的異位內(nèi)膜細(xì)胞的存活能力，使病灶萎縮，最終達(dá)到治療目的。同時(shí)提示藥物濃度對(duì)Bcl-2、Fas、Caspase-3的表達(dá)可能有影響，但有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

圖2 Western-Blot結(jié)果

4 討論

細(xì)胞凋亡是通過(guò)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)死亡機(jī)制，最后導(dǎo)致細(xì)胞的程序性變性和壞死的過(guò)程。其基本過(guò)程是誘導(dǎo)因子刺激細(xì)胞表面，信號(hào)傳入，而激活內(nèi)源性脫氧核糖核酸，從而導(dǎo)致細(xì)胞的自然死亡。此過(guò)程參與有機(jī)體的發(fā)育生殖、老化、免疫等生理過(guò)程，增殖性疾病、腫瘤、自身免疫疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展均與此關(guān)系密切。

4.1 Bcl-2在EM中的作用

細(xì)胞凋亡由許多癌基因和抑癌基因調(diào)控，Bcl-2基因家族在其中占據(jù)重要地位。Bcl-2基因家族是一組具有同源結(jié)構(gòu)域(BH)基因，已發(fā)現(xiàn)有超過(guò)20的Bcl-2家族成員，由于BH成分的差異，Bcl-2家族成員的生物學(xué)功能不同，Bcl-2家族分為以下兩組:第一、抗凋亡成員，如Bcl-2，Bcl XL，Bcl-w等;第二、如Bax，Bak，Bid等則屬于促凋亡成員。研究表明，體內(nèi)Bcl-2家族發(fā)揮作用的形式為二聚體。抗凋亡成員主要分布于線粒體外膜，并與促凋亡成員BH3結(jié)構(gòu)域相互作用，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用，抑制細(xì)胞凋亡。

凋亡抑制基因Bcl-2相關(guān)蛋白主要存在于核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體膜上。許多正常組織及腫瘤組織中均有Bcl-2的表達(dá)，但除外淋巴組織，該基因若過(guò)度表達(dá)，可以防止或延遲正常細(xì)胞分化，延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命，增加細(xì)胞的數(shù)量，而引起腫瘤或增殖性疾病。在月經(jīng)周期中，細(xì)胞凋亡及其調(diào)控基因在子宮內(nèi)膜周期性變化中起重要作用。Bcl-2在正常子宮內(nèi)膜中的增殖期表達(dá)增加，Bas亦上升，Bcl-2/Bas比值維持相對(duì)平衡，減少在正常子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞通過(guò)線粒體途徑引起的細(xì)胞凋亡，從而使內(nèi)膜正常增殖及修復(fù);而分泌期Bcl-2表達(dá)則急速下調(diào)，BAS轉(zhuǎn)移到線粒體與Bcl-2結(jié)合，Caspase激活，而使Bcl-2持續(xù)高表達(dá)，而得以逃避凋亡，利于子宮內(nèi)膜的修復(fù)。有報(bào)道稱(chēng)，EM中Bcl-2在異位內(nèi)膜中強(qiáng)表達(dá)，且無(wú)明顯周期性變化，增殖期、分泌期均強(qiáng)表達(dá)，與正常子宮內(nèi)膜及非異位內(nèi)膜中存在顯著差異。

4.2 Fas在EM中的作用

Fas在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中是一個(gè)重要膜蛋白分子。研究表明，F(xiàn)as介導(dǎo)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡，可能是子宮內(nèi)膜病變發(fā)生的關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as主要于子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞和/或胞漿中表達(dá)。大量研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as表達(dá)在子宮內(nèi)膜中減少，則免疫細(xì)胞(如NK細(xì)胞)無(wú)法有效去除Fas陽(yáng)性的免疫細(xì)胞，反誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生主動(dòng)免疫耐受過(guò)程，導(dǎo)致逆流到盆腔的子宮內(nèi)膜細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視，活性高而利于異位植入成活，促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。因此，提示Fas/FasL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是其共同發(fā)病機(jī)制。

4.3 Caspase-3在EM中的作用

細(xì)胞凋亡是各種死亡信號(hào)激活后，細(xì)胞死亡的主動(dòng)過(guò)程。Caspase-3家族在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中作用關(guān)鍵，為多條凋亡途徑的關(guān)鍵點(diǎn)，是細(xì)胞凋亡的最終途徑。大量的研究已經(jīng)證實(shí)，Caspase-3是Caspase家族中與凋亡最密切的基因，因其位于兩條細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的中心，直接參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此，Caspase-3能夠反應(yīng)細(xì)胞凋亡的程度。

以上我們可以看出，Bcl-2的高表達(dá)及Fas、Caspase-3的低表達(dá)可下調(diào)異位內(nèi)膜的凋亡率，使細(xì)胞周期延長(zhǎng)。而異位內(nèi)膜細(xì)胞正是因?yàn)槿叩鞍妆磉_(dá)的改變，使其凋亡率遠(yuǎn)低于正常子宮內(nèi)膜及EM的在位內(nèi)膜，并延長(zhǎng)了異位內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)周期，故異位病灶可以不斷發(fā)展。

根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，異位寧高劑量組及低劑量組可顯著降低Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率，升高Fas、Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)率，說(shuō)明異位寧能夠降低Bcl-2表達(dá)，增加Fas、Caspase-3表達(dá)，增強(qiáng)宮腔外種植的異位內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡能力，同時(shí)減弱異位內(nèi)膜細(xì)胞的存活能力，使病灶萎縮，最終達(dá)到治療目的。可以預(yù)見(jiàn)，中藥異位寧作為作為Bcl-2、Fas、Caspase-3選擇性抑制劑將會(huì)更廣泛地應(yīng)用到臨床，為中藥異位寧治療子宮內(nèi)膜異位癥的機(jī)理研究提供了新的思路。

［1］郎景和.子宮內(nèi)膜異位癥的研究與設(shè)想［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2003，38(8):478-480.

［2］馬小娜，閆軍堂，任國(guó)輝，等.子宮內(nèi)膜異位癥中醫(yī)病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)探討［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2012，40(3):63-66.

［3］周應(yīng)芳.子宮內(nèi)膜異位癥的臨床診斷和治療［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2005，40(1):67-70.