褐藻素誘導人宮頸癌HeLa細胞的自噬作用機制研究

廖政邦，于五輩，趙 輝#（1.東莞市第五人民醫院，廣東東莞 53900；.河南大學藥學院化學生物學研究所，河南開封 475004）

宮頸癌是病死率最高的常見婦科腫瘤，嚴重威脅著女性健康。復發的宮頸癌往往對臨床常用的抗腫瘤藥物耐藥，因此亟需開發以新方式引起腫瘤細胞死亡的藥物以克服耐藥[1]。自噬是繼凋亡和壞死后發現的第3種細胞死亡形式，雖然細胞通過自噬可以降解受損、衰老和失去功能的大分子或細胞器，維持細胞的內穩態，但自噬的過度激活又會損傷細胞器，促進自噬性細胞死亡。近年來發現很多藥物可通過誘導腫瘤細胞自噬產生抗腫瘤作用，例如維生素K3可通過細胞外調節蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases，ERK）途徑介導宮頸癌HeLa細胞發生自噬[2]；麥冬皂苷B通過抑制蛋白激酶B（Protein kinase B，PKB，又稱Akt）、哺乳動物雷帕雷素靶蛋白（mTOR）通路介導HeLa細胞自噬[3]。以上研究表明，誘導腫瘤發生自噬是研發抗腫瘤藥物的一種有效策略[4]。

褐藻素（Fucoxanthin）是一種具有獨特結構的海洋類胡蘿卜素成分，具有消痰、軟堅散結、利水作用。現代醫學研究表明，褐藻素具有抗腫瘤、促凋亡、抗炎及清除自由基等藥理作用。已有研究表明，褐藻素可通過抑制Akt、mTOR的磷酸化來誘導肝癌HepG2細胞發生凋亡和自噬[5]。由于藥物抗腫瘤作用機制往往取決于腫瘤類型，因而褐藻素是否對宮頸癌具有抗腫瘤作用尚不得而知，本研究對褐藻素抗宮頸癌作用及其分子機制進行了研究。

1 材料

1.1 儀器

FACSCalibur型流式細胞儀（美國BD公司）；DMI3000B型倒置熒光顯微鏡（德國徠卡公司）；Multiskan Spectrum型全波長酶標儀（美國熱電公司）。

1.2 藥品與試劑

胰蛋白酶、RPMI1640培養液、胎牛血清（美國Gibco公司）；褐藻素（純度：98.0%）、洛霉素A1（Baf A1，純度：98.0%）、新雷素（純度：＞98%）、氯化銨（NH4Cl）、MTT、核糖核酸酶（RNase）A、吖啶橙、3-甲基腺嘌呤（3-MA，純度：98.0%）、U0126（純度：98.0%）、碘化丙啶、一抗均購自美國Sigma公司；細胞裂解液試劑盒、Lyso-Tracker Red、Hoechst33342、AnnexinⅤ-FITC凋亡試劑盒均購于上海碧云天生物技術有限公司；Akt一抗、phospho-Akt（p-Akt）一抗、p21一抗、CDK2一抗、Cyclin D1一抗、Phospho-p70S6 kinase（p-p70S6K，Thr389）一抗、PTEN一抗、Phospho-mTOR（p-mTOR）一抗均購于美國Cell Signaling Technology公司；Beclin-1、LC3及相應二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.3 細胞

HeLa細胞購于中國科學院上海細胞生物學研究所。

2 方法

2.1 細胞的培養[5]

細胞凍存液清洗后，加入RPMI1640培養液重懸細胞沉淀至細胞培養瓶中，置37 ℃、5%CO2培養箱中培養。

2.2 細胞抑制率測定

取對數生長期的細胞，調整細胞密度為5×105ml－1并接種于96孔培養板，培養12 h使細胞貼壁。以1、10、20、40、80 μmol/L褐藻素，1、10、20、40、80 μmol/L褐藻素+3-MA（5 mmol/L）培養細胞48 h。于試驗終止前4 h每孔加入MTT（5 mg/ml）10 μl，37 ℃下繼續孵育4 h后，終止培養。每孔加入二甲基亞砜100 μl，37 ℃下振蕩30 min后，以酶標儀于570 nm波長處測定光密度（OD），以OD代表細胞活力并計算細胞抑制率與半數抑制濃度（IC50）[5]。

2.3 細胞周期與凋亡測定

取對數生長期的細胞，調整細胞密度為5×105ml－1并接種于96孔培養板，培養12 h使細胞貼壁。以0（空白對照）、10、20、40 μmol/L褐藻素培養細胞48 h。同一濃度重復3孔。培養細胞結束后以70%冰冷乙醇固定過夜，RNase A（50 μg/ml）處理后碘化丙啶（100 g/ml）避光染色，以流式細胞儀分析細胞周期分布；培養細胞結束后按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書處理細胞，以流式細胞儀分析細胞凋亡率[5]。

2.4 細胞自噬測定（自噬劑：3-MA）

2.4.1 吖啶橙染色法 取對數生長期的細胞，以5 000個/孔細胞接種于6孔板，以40 μmol/L褐藻素培養細胞48 h，棄去培養基。同一濃度重復3孔。吖啶橙（1 mg/ml）避光染色15 min，熒光顯微鏡觀察并拍照，當細胞內酸性小囊泡增多時吖啶橙由綠色熒光轉變成紅色熒光。自噬抑制性試驗則加入自噬抑制劑3-MA（5 mmol/L）培養細胞2 h后，再加入40 μmol/L褐藻素培養細胞48 h，棄去培養基，染色方法同上[6]。試驗設空白對照（0 μmol/L）。

2.4.2 Lyso-Tracker Red染色法 取對數生長期的細胞，以5 000個/孔細胞接種于6孔板，以40 μmol/L褐藻素培養細胞48 h，棄去培養基。同一濃度重復3孔。加入Lyso-Tracker Red（50 nmol/L）37 ℃避光染色45 min，Hoechst 33342（1 μmol/L）復染15 min，熒光顯微鏡觀察并拍照，當溶酶體數量增加時紅色熒光增強。自噬抑制性試驗則加入自噬抑制劑3-MA（5 mmol/L）培養細胞2 h后再加入40 μmol/L褐藻素培養細胞48 h，棄去培養基，染色方法同上[6]。試驗設空白對照（0 μmol/L）。

2.4.3 穩定轉染HeLa-GFP-LC3細胞測試法 選擇對數生長期細胞加入自噬抑制劑3-MA（5 mmol/L）培養細胞2 h，進行pGFP-LC3質粒轉染，用新霉素篩選細胞克隆。收獲HeLa-GFP-LC3細胞以5 000個/孔接種于6孔板，40 μmol/L褐藻素培養細胞48 h后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，熒光顯微鏡觀察并拍照。細胞內綠色熒光呈點狀分布則說明細胞發生自噬，反之呈彌散性綠色熒光。對于自噬抑制性試驗則為加入自噬抑制劑3-MA（5 mmol/L）培養細胞2 h后再加入40 μ mol/L褐藻素培養細胞48 h，棄去培養基，染色方法同上[7]。試驗設空白對照（0 μmol/L）。

2.5 細胞自噬相關蛋白的測定

以Western blot法測定蛋白表達。取對數生長期的細胞，調整細胞密度為5×105ml－1并接種于96孔培養板，培養12 h使細胞貼壁，單獨加入40 μmol/L褐藻素或者先加入自噬抑制劑3-MA（5 mmol/L）或U0126（10 μmol/L）培養細胞2 h后再加入40 μmol/L褐藻素，繼續培養細胞48 h后，PBS洗3次，以離心半徑為13.5 cm、1 000 r/min離心5 min后用細胞裂解液裂解細胞。同一濃度重復3孔。蛋白定量后取50 μg蛋白加入上樣緩沖液，95 ℃變性10 min。8%聚丙烯酰胺-十二烷基磺酸鈉（SDS）凝膠電泳，電轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉后依次加入相應的一抗和二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌5次，每次10 min。凝膠成像系統分析細胞自噬相關蛋白條帶[5]。試驗設空白對照（0 μmol/L）。

2.6 自噬流量測定

取對數生長期的細胞，調整細胞密度為5×105ml－1并接種于96孔培養板，培養12 h使細胞貼壁。單獨加入10 μmol/L褐藻素或先加入自噬抑制劑Baf A1或NH4Cl后，再加入10 μmol/L褐藻素，繼續培養細胞48 h，測定LC-3Ⅰ、LC-3Ⅱ、p62表達水平。對于溶酶體內Cathepsin D檢測，則分別加入10、20、40 μmol/L褐藻素培養細胞48 h后，PBS洗3次，以離心半徑為13.5 cm、1 000 r/min離心5 min，用細胞裂解液裂解細胞后，測定Cathepsin D表達水平。同一濃度重復3孔。蛋白定量后取50 μg蛋白加入上樣緩沖液，95 ℃變性10 min。8%聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳，電轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉后依次加入相應的一抗和二抗，室溫孵育2 h，TBST緩沖液洗滌5次，每次10 min。凝膠成像系統分析蛋白條帶[5]。試驗設空白對照（0 μmol/L）。

2.7 統計學方法

采用SPSS 12.0軟件處理試驗數據。各組數據均為計量資料，以表示，采用t檢驗進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 細胞抑制率測定結果

1、10、20、40、80 μmol/L褐藻素培養細胞48 h后，對細胞生長具有明顯抑制作用，且呈濃度依賴關系，IC50為（55.1±7.6）μmol/L。細胞抑制率測定結果見表1。

表1 細胞抑制率測定結果（，n＝3）Tab 1 Determination results of cell inhibition rate（，n＝3）

表1 細胞抑制率測定結果（，n＝3）Tab 1 Determination results of cell inhibition rate（，n＝3）

3.2 細胞周期與凋亡測定結果

與空白對照比較，10、20、40 μmol/L褐藻素培養細胞48 h后，可劑量依賴性地阻滯細胞于G0/G1期，但對細胞凋亡無顯著影響。細胞周期與凋亡測定結果見表2。

表2 細胞周期與凋亡測定結果Tab 2 Determination results of cell cycle and apoptosis

3.3 細胞自噬測定結果

吖啶橙染色結果表明，經40 μmol/L褐藻素處理48 h后，HeLa細胞內紅色熒光明顯增強，提示細胞內的酸性小囊泡增多；Lyso-Tracker Red染色結果進一步提示褐藻素可誘導溶酶體數量的增多及活性的增強；HeLa-GFP-LC3細胞內點狀綠色熒光明顯增多，而空白對照細胞內呈現彌散性綠色熒光。細胞自噬測定結果見圖1。

圖1 細胞自噬與相關蛋白測定結果（×20）A.吖啶橙染色；B.LysoTracker Red染色；C.HeLa-GFP-LC3細胞測試法；D.Beclin-1和LC3Ⅰ、LCⅡ表達；E.p-Akt、p-mTOR、p-p70S6K、Cyclin D1、CDK2、PTEN、p21表達Fig 1 Determination results of autophagy and related protein（s×20）A.acridine orange staining；B.LysoTracker Red staining；C.HeLa-GFPLC3 cell method；D.Beclin-1 and LC3Ⅰ，LCⅡexpression；E.p-Akt，p-mTOR，p-p70S6K，Cyclin D1，CDK2，PTEN，p21 expression

3.4 細胞自噬相關蛋白的測定結果

40 μmol/L褐藻素可增強自噬標志性蛋白Beclin-1的表達，可促進LC3 Ⅰ轉變為LC3 Ⅱ，提示褐藻素誘導細胞發生了自噬。與空白對照比較，40 μmol/L褐藻素作用細胞48 h后，p-Akt及其下游靶蛋白p70S6K和p-mTOR表達減弱，總Akt蛋白表達并無明顯改變；Akt信號通路的負調控蛋白PTEN表達增強，提示褐藻素通過Akt/mTOR信號通路誘導HeLa細胞發生了自噬。與空白對照比較，40 μmol/L褐藻素可抑制CDK2、Cyclin D1蛋白表達，增強p21蛋白表達。自噬抑制劑3-MA幾乎完全逆轉褐藻素對HeLa細胞的生長抑制作用，但對細胞凋亡無明顯影響，提示褐藻素的生長抑制作用取決于自噬的發生。此外，3-MA部分逆轉褐藻素對自噬相關蛋白表達的調控。細胞自噬相關蛋白的測定結果（自噬劑：3-MA）見圖1。

3.5 細胞自噬流量測定結果

自噬的發生是一個連續的動態過程，自噬流量的檢測能反映該過程。Baf A1是囊泡H+ATPases特異性抑制劑，可抑制酸性溶酶體和自噬體/溶酶體的形成。結果顯示Baf A1可明顯增加褐藻素誘導的LC3 Ⅱ蛋白的表達。NH4Cl通過抑制溶酶體酸化可以抑制自噬底物的降解，結果顯示NH4Cl明顯逆轉了褐藻素誘導的p62表達降低。此外，褐藻素濃度依賴性地誘導分布在溶酶體內Cathepsin D表達上調。細胞自噬流量測定結果（自噬劑：Baf A1或NH4Cl）見圖2。

3.4 細胞自噬相關蛋白測定結果（自噬劑：U0126）

綜合上述試驗可知，自噬發生的分子機制涉及多種信號通路。由于3-MA并不完全抑制褐藻素對AKT/mTOR信號通路中關鍵蛋白的調控，提示可能有其他信號通路參與褐藻素誘導的細胞自噬。經過篩選，筆者發現褐藻素活化MEK/ERK信號通路，而MEK抑制劑U0126不僅可以抑制MEK/ERK信號通路的活化，而且可以部分逆轉褐藻素誘導的Beclin-1表達增強及LC3 Ⅰ轉變為LC3 Ⅱ，提示MEK/ERK信號通路也參與了褐藻素誘導的細胞自噬。細胞自噬相關蛋白測定結果（自噬劑：U0126）見圖3。

圖2 細胞自噬流量測定結果（自噬劑：Baf A1或NH4Cl）A.褐藻素+Baf A1；B.褐藻素+NH4Cl；C.褐藻素Fig 2 Determination results of autophagy flow of cell（sautophagy agent：Baf A1 or NH4Cl）A.fucoidan+Baf A1；B.fucoxanthin+NH4Cl；C.fucoxanthin

圖3 細胞自噬相關蛋白測定結果（自噬劑：U0126）Fig 3 Determination results of autophagy related proteins（autophagy agent：U0126）

4 討論

自噬在腫瘤化療中的作用目前仍未完全闡明，腫瘤細胞通過發生自噬得以存活并對抗藥物的治療作用，抑制自噬可以促進細胞凋亡，而一些抗腫瘤藥物通過誘導腫瘤細胞發生自噬從而產生治療作用[8]。本研究表明，褐藻素的抗HeLa細胞增殖作用幾乎完全被自噬抑制劑3-MA逆轉，說明其抗增殖作用是通過自噬產生的。此外，褐藻素并不誘導HeLa細胞發生凋亡，這與以前的研究結果不同：褐藻素誘導人肝癌HepG2細胞同時發生自噬和凋亡，且自噬是抑制凋亡[5]。以上結果提示褐藻素可通過不同的機制產生抗腫瘤作用，具有腫瘤細胞特異性。

自噬的發生是一個動態的連續過程，待降解物質由雙層膜包裹而形成自噬體，隨后與溶酶體融合并形成自噬溶酶體，溶酶體內的酸性水解酶消化水解待降解物質并釋放回細胞質中，從而實現物質的循環利用[9]。褐藻素引起HeLa細胞內吖啶橙的紅色熒光和Lyso-Tracker Red的紅色熒光增強，提示褐藻素誘導HeLa細胞發生了自噬。此外，Beclin-1表達增加、LC3Ⅰ轉變為LC3Ⅱ和HeLa-GFP-LC3轉染細胞試驗均進一步證實褐藻素誘導HeLa細胞發生了自噬。

Akt/mTOR信號通路往往參與細胞自噬的發生[10]。研究結果表明，褐藻素能明顯調控Akt/mTOR信號通路中一些關鍵蛋白，如Akt、mTOR、p70S6K的磷酸化以及上調PTEN（Akt/mTOR信號通路的負調控蛋白）的表達，提示褐藻素誘導HeLa細胞發生的自噬是通過抑制該信號通路中關鍵蛋白的活化產生的。由于3-MA并不完全抑制褐藻素對Akt/mTOR信號通路中關鍵蛋白的調控，提示可能有其他信號通路參與褐藻素誘導的細胞自噬。經過篩選發現，褐藻素通過使MEK1/2和ERK1/2磷酸化從而活化MEK/ERK信號通路，進一步研究表明MEK抑制劑U0126不僅可以抑制MEK/ERK信號通路的活化，而且可以部分逆轉褐藻素誘導的Beclin-1表達增加及LC3 Ⅰ轉變為LC3 Ⅱ，提示MEK/ERK信號通路也參與了褐藻素誘導的細胞自噬，即褐藻素通過抑制AKT/mTOR信號通路和激活MEK/ERK信號通路共同介導了HeLa細胞的自噬。此外，褐藻素是通過抑制p53、CDK2、Cyclin D1的表達以及促進p21的表達從而誘導HeLa細胞周期阻滯于G0/G1期。實驗結果表明，褐藻素可誘導宮頸癌HeLa細胞發生自噬和細胞周期阻滯于G0/G1期，但并不誘導細胞凋亡。預孵自噬抑制劑3-MA后，褐藻素抗增殖作用被逆轉，提示褐藻素抗HeLa細胞的作用取決于自噬，進一步研究表明褐藻素是通過抑制Akt信號通路以及激活MEK/ERK信號通路誘導HeLa細胞自噬。

本研究進一步完善了褐藻素抗腫瘤作用的分子機制，并為其應用于臨床提供了理論基礎和實驗依據。

[1]Shigetomi H，Higashiura Y，Kajihara H，et al.Targeted molecular therapies for ovarian cancer：an update and future perspectives[J].Oncol Rep，2012，28（2）：395.

[2]于春艷，劉希，于春榮，等.維生素K3誘導氧化應激經ERK信號途徑介導HeLa細胞發生自噬[J].吉林大學學報，2014，40（2）：229.

[3]許秋菊，侯莉莉，胡國強，等.麥冬皂苷B誘導人宮頸癌HeLa細胞自噬的機制[J].藥學學報，2013，48（6）：855.

[4]Ouyang L，Shi Z，Zhao S，et al.Programmed cell death pathways in cancer：a review of apoptosis，autophagy and programmed necrosis[J].Cell Prolif，2012，45（6）：487.

[5]廖政邦，李明，謝松強.褐藻素誘導肝癌HepG2細胞凋亡和自噬的機制[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（15）：181.

[6]張艷霞，吳勇杰，李文廣.蛇葡萄素鈉協同卡鉑對人肺腺癌GLC-82細胞增殖的抑制作用[J].中國藥房，2015，26（4）：488.

[7]童洋飛，郭奉潔，潘夕春，等.雷公藤甲素對大鼠心肌H9c2細胞肥大的抑制作用[J].中國藥房，2015，26（7）：878.

[8]Abrahamsen H，Stenmark H，Platta HW.Ubiquitination and phosphoryla tion of Beclin 1 and its binding partners：tuning class Ⅲphosphatidylinositol 3-kinase activity and tumor suppression[J].FEBS Lett，2012，586（11）：1 584.

[9]Gordy C，He YW.The crosstalk between autophagy and apoptosis：where does this lead[J].Protein Cell，2012，3（1）：17.

[10]Zou CY，Smith KD，Zhu QS，et al.Dual targeting of AKT and mammalian target of rapamycin：a potential therapeutic approach for malignant peripheral nerve sheath tumor[J].Mol Cancer Ther，2009，8（5）：1 157.