微乳法制備姜黃素固體脂質納米粒Δ

李 楠，李錫晶，王 倩（天津市醫藥科學研究所，天津 300020）

研究表明，傳統中藥姜黃中的主要活性成分姜黃素（Curcumin，Cur）抑制腫瘤細胞生長的效果顯著、抗癌譜廣、毒副作用小，是一種具有良好應用前景的抗癌新藥，但因其水溶性極差、口服生物利用度低，限制了其在臨床上的應用[1-2]。

固體脂質納米粒（Solid lipid nanoparticles，SLN）是一種可替代聚合物納米粒和脂質體的新型膠體給藥系統，既具備物理穩定性高、藥物不易泄露的優勢，又兼具了低毒、緩控釋、靶向、提高生物利用度、耐受性好等優點[3]。微乳一般呈透明或半透明狀，粒徑在100 nm以內，通常由油、水、乳化劑和助乳化劑4種成分組成。本研究以微乳法制備固體脂質納米粒，將Cur包裹于固體脂質納米粒內，以提高Cur穩定性并改善其水溶性。先采用單因素試驗進行初步篩選，再采用正交試驗法優選確定，得出微乳法制備Cur-SLN的優化工藝，并驗證其重現性。結果證明，建立的方法操作簡便、可行，為開發Cur給藥新劑型提供了依據。

1 材料

1.1 儀器

Spectrum-754型紫外-可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；UV-2450型紫外掃描檢測儀（日本Shimadzu公司）；Zetasize粒度及Zeta電位分析儀（英國Malvern公司）；XW-80A型渦旋混合儀（上海醫科大學儀器廠）；RE-5285A型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；90-2型定時恒溫磁力攪拌器（上海滬西分析儀器廠）；超純水機（德國Pall公司）。

1.2 藥品與試劑

Cur對照品（南京澤朗醫藥科技有限公司，批號：20140226，純度：99.0%）；Cur原料藥（天津一方科技有限公司，批號：20130312，供含量測定用）；聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40，德國Basf公司，批號：20120620）；大豆卵磷脂（以下簡稱磷脂，批號：20120523）、聚乙二醇400（PEG-400，批號：20120811）均購自天津市光復精細化工研究所；泊洛沙姆188（F68，南京威爾化工有限公司，批號：20130108）；葡聚糖凝膠G-50（上海藍季科技有限公司，批號：131118）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 影響空白微乳形成的因素考察

偽三元相圖是進行微乳處方篩選的重要依據，對微乳形成所需的三相因素進行考察，得出微乳制備的最優條件[4-5]。

2.1.1 不同乳化劑的微乳相圖繪制 采用乳化劑/乙醇/硬脂酸/水系統，選擇聚山梨酯80、RH40、磷脂及F68作為乳化劑，65 ℃下制備偽三元相圖。

圖1 不同乳化劑對微乳偽三元相圖的影響（Km＝1 ∶4，溫度：65 ℃）Fig 1 Effects of different emulsifiers on the pseudo-ternary phase diagram of microemulsion（Km＝1∶4，T＝65 ℃）

由圖1可見，RH40為乳化劑時所形成的微乳區域最大，但在室溫下不穩定，由其制備的SLN粒徑較大、體系不穩定；聚山梨酯80為乳化劑時形成的微乳區域較大，且室溫下穩定，制備的SLN粒徑較小，放置9個月以上體系仍穩定。故選擇微乳的乳化劑為聚山梨酯80。

2.1.2 助乳化劑對微乳形成的影響 采用聚山梨酯80/助乳化劑/硬脂酸/水系統，分別選擇乙醇、PEG-400、異丙醇和1，2-丙二醇作為助乳化劑，Km＝1∶4，65 ℃下制備偽三元相圖，見圖2。由圖2可知，乙醇作助乳化劑時，微乳透光性與流動性很好，且有明顯的淡藍色乳光，4 ℃放置9個月以上仍能保持穩定；異丙醇作助乳化劑時的微乳形成區域較乙醇小，且放置10 d后穩定性下降，有沉降物出現；1，2-丙二醇和PEG-400作助乳化劑時，微乳形成區域較異丙醇更小，且由于本身有較大的黏度，所形成的微乳流動性不如乙醇與異丙醇。故選擇乙醇為制備微乳的助乳化劑。

圖2 不同助乳化劑對微乳偽三元相圖的影響（Km＝1 ∶4，溫度：65 ℃）Fig 2 Effects of different co-emulsifiers on the pseudo-ternary phase diagram of microemulsion（Km＝1 ∶4，T＝65 ℃）

2.1.3 不同Km值的影響 以Km為1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5和1 ∶6的比例配成不同的聚山梨酯80/乙醇溶液，65 ℃下繪制相圖。結果，隨著Km減小，微乳區域面積減小，表明乳化劑用量大有利于微乳的形成。助乳化劑可以調節乳化劑的親水親油平衡值，使與相應的油相適應，形成穩定的微乳。各比例下都可用水無限稀釋至頂點。當Km＝1 ∶4時，微乳的形成區域最大，且微乳穩定性最好，故確定此Km值制備微乳。

2.2 葡聚糖凝膠柱層析測定Cur-SLN包封率方法的建立

2.2.1 層析柱洗脫曲線的繪制 采用葡聚糖凝膠柱法，取葡聚糖凝膠G-50適量，裝柱，柱床高22 cm。分別取空白SLN混懸液和Cur的甲醇飽和溶液各0.5 ml上柱，以蒸餾水為洗脫液進行洗脫，流速控制在1 ml/min，每5 ml收集1試管（共收集20管），422 nm波長處測定吸光度，繪制洗脫曲線。結果表明，空白SLN與游離Cur實現良好分離，且洗脫峰形良好，游離Cur在40～65 ml洗脫液中，詳見圖3。

圖3 洗脫曲線（22 cm）Fig 3 Elution curve（22 cm）

2.2.2 柱回收率的考察 制備低、中、高3種不同質量濃度的Cur甲醇標準溶液，分別取0.5 ml上樣，收集40～65 ml段溶液，測定并計算回收率。結果平均柱回收率為102.56%、100.61%、100.52%，RSD分別為0.55%、0.53%、1.07%（n＝3）。

2.2.3 加樣回收率的考察 用SLN混懸液配制Cur低、中、高3種不同質量濃度的混合液，分別取0.5 ml上樣，收集40～65 ml段溶液，測定并計算回收率。結果平均加樣回收率分別為98.15%、99.10%、99.12%，RSD分別為0.74%、0.12%、0.20%（n＝3），回收率能滿足定量要求。

用“%”的形式,表示2組治療效果、不良反應發生情況,并用卡方值檢驗,在用SPSS20.0軟件核對后,當2組社區糖尿病患者的各指標數據有差別時,用P<0.05表示。

2.2.4 Cur-SLN混懸液包封率測定方法（1）游離藥物含量的測定：吸取Cur-SLN混懸液0.5 ml上柱，用蒸餾水洗脫，精密收集40～65 ml段溶液，混勻，甲醇定容至100 ml，測定并計算游離藥物的含量。（2）總藥物含量的測定：吸取Cur-SLN混懸液0.5 ml，用甲醇定容至10 ml，再吸取1 ml用甲醇稀釋至25 ml，測定并計算總藥物的含量。根據包封率（EE）公式（見“2.5.1”項）計算EE。

2.3 Cur-SLN中Cur的紫外分光光度法測定

將Cur對照品和空白SLN分別用甲醇稀釋定容后，在200～700 nm范圍內進行全波長掃描。結果Cur在422 nm波長處有最大吸收峰，而此處空白SLN幾乎無吸收，表明紫外分光光度法對姜黃素特異性良好，因此可確定422 nm波長為測定波長。以吸光度（y）與質量濃度（x）進行回歸得線性方程為y＝0.142 3x+0.013 4（r＝0.999 6），Cur檢測質量濃度線性范圍為1～11 μg/ml，相關方法學考察均符合要求。

2.4 微乳法制備載藥SLN的工藝[7]

稱取處方量的Cur、硬脂酸，65 ℃熔化，加適量相同溫度的Km＝1 ∶4的聚山梨酯80/乙醇溶液及適量蒸餾水，渦旋1 min即可形成O/W型微乳。使用自行設計的微乳注入裝置，距離冷卻水相表面的距離約6 cm，在電磁攪拌下（1 000 r/min）將熱微乳以1滴/s的速度滴入溫度為2 ℃的水分散介質中，當微乳全部加入后繼續以2 ℃保溫攪拌15 min，即得SLN。

2.5 Cur-SLN的評價指標

2.5.1 EE和載藥量的測定 采用下式計算EE（%）和載藥量（DL，%）[8]：

式中：m總為總藥物的質量；m游離為游離藥物的質量；m脂為脂質量；m乳化為乳化劑和助乳化劑的質量。

2.5.2 粒徑分布、多分散指數和Zeta電位的測定 將Cur-SLN用去離子水稀釋適當的倍數后，測定粒徑、Zeta電位及多分散指數（PI）值。

2.6 單因素考察

考察選用不同乳化劑、脂質材料、脂質用量、藥脂比、冷水相溫度、微乳保溫溫度制備所得Cur-SLN的粒徑、Zeta電位、PI值等指標。

2.6.1 不同乳化劑 固定硬脂酸用量為0.5 g，Km＝1 ∶4，硬脂酸與乳化劑溶液質量比為1 ∶10，投藥量均為50 mg，固定其他制備條件，分別以聚山梨酯80、RH40及F68作為乳化劑，制備Cur-SLN。測定粒徑、Zeta電位和PI值，結果見表1。

由表1及試驗中觀察可見，聚山梨酯80制得SLN的粒徑最小，RH40制得的粒徑最大，粒徑分布也最寬（PI高），且室溫放置有絮狀物析出；而F68制得SLN的粒徑分布最窄，但放置一段時間后略有混濁。結合偽三元相圖篩選結果，選用聚山梨酯80為乳化劑。

表1 選用不同乳化劑、脂質材料、脂質用量所制SLN的各指標檢測結果（n＝3）Tab 1 Results of indexes determination of SLN prepared with different emulsifiers，lipid materials，and amounts of lipids（n＝3）

2.6.2 不同脂質材料 以聚山梨酯80為乳化劑，乙醇為助乳化劑，Km＝1 ∶4，投藥量均為50 mg，固定其他制備條件，改變脂質種類，分別選用單硬脂酸甘油酯、硬脂酸和磷脂，固定其用量為0.5 g，使其與乳化劑溶液的質量比為1 ∶10，制備Cur-SLN。測定粒徑、Zeta電位和PI。經綜合評價選用硬脂酸作為脂質材料，詳見表1。

2.6.3 不同脂質用量 以硬脂酸為脂質，聚山梨酯80為乳化劑，乙醇為助乳化劑，Km＝1 ∶4，投藥量均為50 mg，固定其他制備條件，改變硬脂酸的用量分別為0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 g，使其與乳化劑溶液質量比為1∶10，制備Cur-SLN。測定粒徑、Zeta電位和PI值。結果隨著脂質用量的增大，粒徑也逐漸變大；而PI值在一定范圍內呈變窄趨勢，達到一定值后反而變寬。故選用脂質用量為0.5 g，詳見表1。

2.6.4 不同藥脂比 以硬脂酸為脂質材料，分別固定脂質用量為0.5、1.0 g，聚山梨酯80為乳化劑、乙醇為助乳化劑，Km＝1 ∶4，固定其他制備條件，改變投藥量，測定粒徑和PI值。結果粒徑隨脂質用量增加而增大，脂質用量為0.5 g時粒徑小于1.0 g時的平均粒徑，前者的PI值也明顯優于后者。粒徑和PI值隨藥物用量的增減無明顯規律，故選藥脂比為1 ∶10，脂質用量為0.5 g，詳見表2。

表2 不同藥脂比對SLN粒徑的影響（n＝3）Tab 2 Effects of different drug-to-lipid ratios on SLN particle size（n＝3）

2.6.5 不同冷水相溫度 以硬脂酸（0.5 g）為脂質材料，投藥量均為50 mg，聚山梨酯80為乳化劑，無水乙醇為助乳化劑，Km＝1 ∶4，固定其他制備條件，控制冷水相溫度為2、10、25 ℃，制備Cur-SLN。測定粒徑、Zeta電位和PI值。結果冷水相溫度在2 ℃時，制備的SLN粒徑和PI值更優，且在4 ℃放置更穩定，詳見表3。

表3 不同冷水相溫度、微乳保溫溫度所制SLN的各指標檢測結果（n＝3）Tab 3 Results of the indexes determination of SLN prepared with different cold water phase temperatures and holding temperatures of microemulsion（n＝3）

2.6.6 微乳保溫溫度 制備條件同“2.6.5”項，控制微乳保溫溫度為65、72、80 ℃，制備Cur-SLN。測定其粒徑、Zeta電位和PI值。結果以65 ℃時制備的SLN粒徑和PI值更優，且在4 ℃放置更穩定，詳見表3。

2.7 正交試驗

根據單因素試驗結果確定影響Cur-SLN的4個主要因素，即硬脂酸用量（A）、Cur的投藥量（B）、冷水相溫度（C）和微乳保溫溫度（D），設計4因素3水平正交設計表L9（34），見表4；以EE和DL為指標優化工藝參數，正交試驗結果見表5，方差分析結果見表6。

表4 因素與水平Tab 4 Factors and levels

表5 正交試驗結果Tab 5 Results of orthogonal test

以EE和DL為衡量指標分別進行直觀分析，由極差值R確定影響因素順序為：A＞B＞C＞D；以因素D為誤差項進行方差分析的結果亦得出相同的結論。其中A因素影響顯著（P＜0.05），因此，確定A1B2C1D1為優化處方，即硬脂酸的用量為0.5 g、Cur投藥量為50 mg、冷水相溫度為2 ℃、微乳保溫溫度為65 ℃。

表6 方差分析結果Tab 6 Results of analysis of variance

2.8 最優處方的驗證

采用優化處方進行3次工藝驗證試驗，制備3批Cur-SLN樣品，對其粒徑、Zeta電位、PI、DL、EE進行測定。結果EE、DL、平均粒徑、PI和Zeta電位的平均值分別為87.73%、7.72%、（156.9±2.2）nm、0.480、－24.8 mV，重現性良好（RSD＜2%，n＝3）。

2.9 Cur-SLN的穩定性研究

將留樣的Cur-SLN置于4 ℃和25 ℃室溫環境下儲存0、1、3個月后，測定樣品的粒徑、Zeta電位及EE，觀察變化。結果放置1個月后無論是在低溫還是室溫下，平均粒徑皆呈不同程度的增大，低溫下約增大1.7～21.4 nm，室溫下約增大172.8～260.4 nm；而EE呈下降的趨勢，低溫下約下降1.3%～18.4%，室溫下約下降12.5%～48.7%。樣品的粒徑和EE變化程度在低溫下比室溫下情況更小，表明低溫更有利于樣品的儲存。

3個月后在低溫下儲存的樣品平均粒徑亦皆不同程度的增大，約增大22.7～72.0 nm；而EE呈現下降的趨勢，低溫下約下降3.2%～21.7%。在室溫下部分樣品出現絮狀沉淀物，無法測定粒徑和EE。這表明所制納米粒不適合在室溫下長時間（3個月）保存。

3 討論

在試驗中發現，去除SLN中的乙醇可采用旋轉蒸發法或冷水介質稀釋揮發法。旋轉蒸發法制得的SLN其平均粒徑及PI均超過標準；而采用冷水介質稀釋揮發法制得的SLN平均粒徑及PI均符合要求。以后一種方法所制得的SLN較清澈，可能系稀釋的原因。

SLN的制備方法主要有高壓乳勻法、薄膜-超聲分散法、微乳法、溶劑擴散法、乳化超聲法、溶劑蒸發法等。馬艷等[9]采用薄膜-超聲分散法制備Cur-SLN，考察卵磷脂、硬脂酸、Cur和聚山梨酯80用量對EE和DL的影響。所得Cur-SLN的EE和DL較高，但納米分散液中可能出現粒徑較大的微米級粒子；且由于使用二氯甲烷和丙酮等有機溶劑制備，若去除不完全會降低安全性。宋金春等[2]采用溶劑蒸發法制備Cur-SLN，以EE為指標進行正交試驗，優選Cur、F68、山崳酸甘油酯和卵磷脂用量，所得Cur-SLN的EE僅為67.4%，且由于其體系中的有機溶劑較難去除需關注安全性。孫冬妮等[10]采用熱熔超聲法制備Cur-SLN，以EE為指標進行正交試驗優選脂質、藥脂比、磷脂和F68用量，所得Cur-SLN的EE為90.23%。本試驗采用微乳法制備Cur-SLN過程簡單，對設備要求低，以EE和DL為指標，正交試驗優選硬脂酸、Cur、冷水相溫度和熱微乳保溫溫度，所得納米粒平均粒徑較小，EE為87.73%。DL和EE均為納米粒的重要考察指標，DL是指對納米粒整體而言藥物含量的高低；而EE則是指投藥后藥物利用率的大小，特別是分散在液體介質中的納米粒，可能其中游離的藥物含量較大，這種情況下EE是一個更加重要的衡量指標。但一味追求高的EE，會消耗過多囊材，導致DL降低，造成服藥量增加。因此，應同時選取兩者為考察指標，以在提高EE的同時兼顧DL。

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