HPLC法測定仿制與原研安立生坦片的體外溶出度

陳保來，孫 霞，仲 艷，李家春，秦建平，黃文哲，王振中，，蕭 偉，#（.南京中醫藥大學，南京 0000；.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇連云港 00）

安立生坦是一種選擇性內皮素受體拮抗藥，可強效抑制內皮素所致的血管收縮，其片劑口服可用于肺動脈高壓（PAH）的治療[1-2]。目前，國內有進口安立生坦片上市。安立生坦為弱酸性（pKa為4.0），在水、0.1 mol/L鹽酸溶液中幾乎不溶，因此安立生坦片的溶出行為可直接影響其體內生物利用度。本研究建立了測定安立生坦片體外溶出度的試驗方法，并考察仿制與原研安立生坦片在不同溶出介質中的溶出曲線。溶出曲線的相似性評價方法較多，主要有模型依賴法（如Weibull分布模型等）和非模型依賴法[如相似因子（f2）法、溶出效率評價法、偏離度法、酸值（AV）法等]。美國食品藥品監督管理局（FDA）及日本厚生勞動省均推薦相似因子法[4]。鑒于單一使用相似因子法的缺陷，本文同時采用f2法與AV值法[4]對其進行相似性評價，為仿制藥質量一致性評價提供參考。

1 材料

LC-20AB HPLC儀，包括LC-20AB泵、SIL-20A自動進樣器、CTO-20AC柱溫箱、SPD-20AV檢測器及LC-Solution工作軟件（日本島津公司）；8CZ-8M溶出試驗儀及RZQ-8D取樣收集系統（天津市天大天發科技有限公司）；BP211D電子天平（北京賽多利斯公司）；KQ-250DB超聲儀（昆山市超聲儀有限公司）。

安立生坦對照品（批號：120501-DZ，純度：99.95%）、安立生坦原料（批號：121001，純度：99.86%）、安立生坦片（批號：131001，規格：5 mg）均由江蘇康緣藥業股份有限公司提供；原研安立生坦片（葛蘭素史克股份有限公司，批號：HPXY，規格：5 mg）；乙腈、三氟乙酸為色譜純，鹽酸、冰醋酸、氫氧化鉀、苯二甲酸氫鉀、磷酸二氫鉀均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.02%三氟乙酸水溶液（60∶40，V/V）；流速：1.2 ml/min；檢測波長：220 nm；柱溫：40 ℃；進樣量：100μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取安立生坦對照品約11 mg，置于100 ml量瓶中，加乙腈50 ml，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理2 min使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取適量，用水、0.1 mol/L鹽酸溶液（pH＝1.0）、醋酸鹽緩沖液（pH＝5.0）、磷酸鹽緩沖液（pH＝6.8）4種溶出介質稀釋制成每1 ml中約含安立生坦5.6μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 根據美國FDA公布的安立關系到坦片溶出方法，并參考相關文獻[5-8]，溶出方法選擇槳法，轉速為50 r/min，分別加入“2.2.1”項下4種溶出介質，溶出體積為900 ml，于5、10、15、20、30、45、60、90、120 min時分別取樣2 ml，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 空白輔料溶液 取不含安立生坦的空白輔料14 mg，置于100 ml量瓶中，加“2.2.1”項下4種溶出介質溶解并稀釋至刻度，濾過，即得。

2.3 系統適用性試驗

取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液及空白輔料溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣，色譜見圖1。結果表明，空白輔料溶液不干擾測定。

圖1 高效液相色譜圖A.空白輔料；B.對照品；C.供試品；1.安立生坦Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank control；B.substance control；C.test sample；1.ambrisentan

2.4 線性關系考察

精密稱取安立生坦對照品5.61 mg，置于100 ml的量瓶中，加入乙腈50 ml溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，得對照品貯備液。精密量取對照品貯備液，加入醋酸鹽緩沖液（pH＝5.0）稀釋至質量濃度為1.14、2.28、2.85、4.55、5.69、6.83 μg/ml的系列對照品溶液。以質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得安立生坦回歸方程為y＝201 403x+10 162（r＝0.999 9）。結果表明，安立生坦質量濃度在1.14～6.83 μg/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，安立生坦峰面積的RSD為0.18%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取安立生坦片細粉（批號：131001）適量（約相當于安立生坦5.6 mg），置于1 000 ml溶出杯中，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于放置5、30、60、90、120、240、360 min時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，安立生坦峰面積的RSD為0.23%，表明供試品溶液在4種溶出介質中6 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

取安立生坦片細粉（批號：131001）適量，按“2.2.2”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，安立生坦含量的RSD為0.26%，表明本方法重復性良好。

2.8 回收率試驗

取安立生坦對照品約2.8、4.2、5.6 mg，各平行3份，置于1 000 ml量瓶中，加入140 mg空白輔料，加入醋酸鹽緩沖液（pH＝5.0）稀釋至刻度，搖勻，濾過，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算回收率，結果見表1。

2.9 與原研藥溶出曲線的比較

取仿制藥（批號：131001）與原研藥（批號：HPXY）各12片，測定每片不同時間的溶出度。平均累積溶出度結果見表2、圖2。

參考相關指導原則及文獻，筆者采用f2法及AV值法兩種互補的非模型依賴法，對仿制藥與原研藥間溶出曲線的相似性進行評價，結果見表3。在0.1 mol/L鹽酸溶液（pH＝1.0）、醋酸鹽緩沖液（pH＝5.0）溶出介質中，全部有效點的AV值均小于15，表明兩條溶出曲線整體相似；f2值大于50，亦表明兩條溶出曲線相似。在水中，存在AV值大于15的有效點，但平均AV值小于15，表明兩條溶出曲線基本相似；f2值大于50，亦表明兩條溶出曲線相似。在磷酸鹽緩沖液（pH＝6.8）溶出介質中，15 min內溶出度達90%以上，表明該溶出介質對兩種產品無區分效應，可判定溶出行為相似，無需進行溶出曲線相似性計算。

3 討論

3.1 溶出介質的選擇

安立生坦pKa為4.0，可看作中性藥，溶出介質pH應選擇1.0或1.2、3.0～5.0、6.8和水[9]。進口安立生坦片溶出度檢測方法及美國FDA網站公布的安立生坦片溶出度條件均選擇醋酸鹽緩沖液（pH＝5.0）。此外，安立生坦pH-溶解度曲線測試結果顯示其溶解度與pH有相關性。綜合考慮上述因素，確定溶出介質為水、0.1 mol/L鹽酸溶液（pH＝1.0）、醋酸鹽緩沖液（pH＝5.0）、磷酸鹽緩沖液（pH＝6.8）。

表2 仿制藥及原研藥在4種溶出介質中的累積溶出度測定結果（，n＝12，%）Tab 2 Accumulative dissolution of domestic and original products of products in 4 kinds of dissolution mediums（，n＝12，%）

表2 仿制藥及原研藥在4種溶出介質中的累積溶出度測定結果（，n＝12，%）Tab 2 Accumulative dissolution of domestic and original products of products in 4 kinds of dissolution mediums（，n＝12，%）

注：“-”表示該時間點未取樣測定溶出度Notes：“-”represents dissolution was not determined at that time point

圖2 仿制藥及原研藥在4種溶出介質中的溶出曲線A.0.1 mol/L鹽酸溶液（pH＝1.0）；B.水；C.醋酸鹽緩沖液（pH＝5.0）；D.磷酸鹽緩沖液（pH＝6.8）Fig 2 Dissolution curves of domestic and original products in 4 kinds of dissolution mediumsA.0.1 mol/L hydrochloric acid solution（pH＝1.0）；B.water；C.acetate buffer solution（pH＝5.0）；D.phosphate buffer solution（pH＝6.8）

3.2 取樣時間點的確定

安立生坦片在水、醋酸鹽緩沖液（pH＝5.0）、磷酸鹽緩沖液（pH＝6.8）中在60 min內均能滿足連續兩點的溶出度在85%以上，且差值在5%以內，取樣時間點選擇為5、10、15、20、30、45、60 min。在0.1 mol/L鹽酸溶液（pH＝1.0）的溶出介質中，選擇的時間點增加90、120 min。

表3 仿制藥及原研藥在4種溶出介質中的AV值與f2值比較Tab 3 Comparison of f2and AV value of domestic and original of products in 4 kinds of dissolution mediums

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