鄰苯二甲醛柱前衍生化HPLC法測定復(fù)方制劑中鹽酸賴氨酸的含量

張 億，朱 蓉，鄭 萍，熊 玲（成都市食品藥品檢測中心，成都 610045）

鹽酸賴氨酸為人體必需的8種氨基酸之一，具有刺激胃蛋白酶與胃酸的分泌、增進(jìn)食欲、提高鈣的吸收及其在體內(nèi)的積累、加速骨骼生長的作用。其常與其他維生素組成復(fù)方制劑，用于調(diào)節(jié)幼兒新陳代謝、促進(jìn)生長與發(fā)育[1]。因此，建立這類復(fù)方制劑中鹽酸賴氨酸含量的測定方法，有利于更加嚴(yán)格地控制制劑的質(zhì)量，保證用藥安全。目前，復(fù)方賴氨酸制劑已有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)多采用甲醛滴定法[2-3]或茚三酮比色法[4-7]，但這兩種方法的專屬性和精密度均不夠高，僅適合于含單一賴氨酸成分且濃度較高的樣品。考慮到復(fù)方制劑中輔料和其他成分都可能會對賴氨酸成分的測定造成干擾，且賴氨酸含量較低，筆者采用了高效液相色譜（HPLC）法，并以鄰苯二甲醛（OPA）試劑對鹽酸賴氨酸進(jìn)行柱前衍生化，這樣不僅解決了鹽酸賴氨酸無發(fā)色基團(tuán)、在紫外檢測器下無特征吸收的問題，而且通過自動進(jìn)樣系統(tǒng)實現(xiàn)了被分析樣品衍生后的在線分析，方法簡便、快速，無需配置特殊衍生設(shè)備。

1 材料

1260 HPLC儀，包括四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、帶二級管陣列的紫外檢測器（美國Agilent公司）；BP211D電子天平（德國Sartorius公司）；KQ-500B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

鹽酸賴氨酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：140624-200805，純度：100%）；五維賴氨酸顆粒（批號：120925，規(guī)格：每克含鹽酸賴氨酸50 mg、維生素B11.2 mg、維生素B20.15 mg、維生素B60.075 mg、煙酰胺2.4 mg、泛酸鈣0.15 mg、枸櫞酸0.09 mg）、賴氨肌醇維B12口服溶液（批號：130605，規(guī)格：每毫升含鹽酸賴氨酸60 mg、維生素B123 μg、肌醇10 mg）、賴氨酸磷酸氫鈣片（批號：1306071，規(guī)格：每片含鹽酸賴氨酸100 mg、磷酸氫鈣100 mg）均為日常監(jiān)督抽檢樣品；OPA為美國Agilent公司市售產(chǎn)品（將鄰苯二醛與3-巰基丙酸混合于硼酸鹽緩沖液中）；甲醇、乙腈為色譜純，硼酸鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉為分析純，水為Millipore超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 鹽酸賴氨酸對照品溶液 取鹽酸賴氨酸對照品約100 mg，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加水溶解并稀釋制成每1 ml中含1 mg鹽酸賴氨酸的對照品貯備液；精密量取上述對照品貯備液10 ml，置于50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋制成每1 ml中含0.2 mg鹽酸賴氨酸的對照品溶液。

2.1.2 五維賴氨酸顆粒供試品溶液（S1）取五維賴氨酸顆粒1 g，置于50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度；精密量取10 ml，置于50 ml量瓶中，加水稀釋制成每1 ml中含0.2 mg鹽酸賴氨酸的供試品溶液。

2.1.3 賴氨肌醇維B12口服溶液供試品溶液（S2）取賴氨肌醇維B12口服溶液1 ml，置于50 ml量瓶中，加水稀釋至刻度；精密量取10 ml，置于50 ml量瓶中，加水制成每1 ml中含0.24 mg鹽酸賴氨酸的供試品溶液。

2.1.4 賴氨酸磷酸氫鈣片供試品溶液（S3）取賴氨酸磷酸氫鈣片10片，研細(xì)，精密稱取約相當(dāng)于50 mg鹽酸賴氨酸的細(xì)粉，置于50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾；精密量取續(xù)濾液10 ml，置于50 ml量瓶中，加水制成每1 ml中含0.2 mg鹽酸賴氨酸的供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.04 mol/L磷酸二氫鈉溶液（10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2）-甲醇-乙腈（70∶15∶15，V/V/V）；流速：1.5 ml/min；柱溫：35 Ⅰ；檢測波長：338 nm。將供試品按照自動衍生化進(jìn)樣程序，與硼酸鹽緩沖溶液（取硼酸鈉15.25 g，加水100 ml溶解，并用45%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至10.2）混合后，再與OPA混合并定時反應(yīng)2 min后，注入HPLC儀中。自動衍生化進(jìn)樣程序見表1。在此色譜條件下，空白溶劑中未見未反應(yīng)的衍生試劑OPA的色譜峰，供試品溶液中未見干擾賴氨酸衍生物色譜峰的雜質(zhì)峰，賴氨酸理論板數(shù)＞3 000。色譜見圖1。

表1 自動衍生化進(jìn)樣程序Tab 1 Automatic derivatization and injection procedure

2.3 線性關(guān)系考察

圖1 柱前衍生化高效液相色譜圖A.空白溶劑；B.對照品；C.供試品Fig 1 Pre-column derivatization HPLC chromatogramsA.blank solution；B.reference；C.test sample

精密稱取鹽酸賴氨酸對照品20 mg，置于25 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，以此溶液作為線性試驗?zāi)敢骸７謩e精密吸取上述線性試驗?zāi)敢哼m量，加水制成質(zhì)量濃度為0.02、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/ml的系列對照品溶液。取上述系列對照品溶液適量，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定。以質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得鹽酸賴氨酸的回歸方程為y＝2.021 9×103x－26.34（r＝0.999 5）。結(jié)果表明，鹽酸賴氨酸質(zhì)量濃度在0.027 4～0.438 8 mg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗

精密量取鹽酸賴氨酸對照品溶液0.5 μl，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，峰面積RSD為0.55%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取“2.1”項下供試品溶液S1、S2、S3各1份，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果，峰面積RSD分別為0.67%、0.58%、0.79%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取五維賴氨酸顆粒、賴氨肌醇維B12口服溶液、賴氨酸磷酸氫鈣片各6份，分別按“2.1”項下方法制成供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣，按外標(biāo)法計算鹽酸賴氨酸的含量。結(jié)果，含量RSD分別為0.78%、0.66%、0.84%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取五維賴氨酸顆粒0.20 g，共9份，分別置于50 ml量瓶中，加入“2.1.1”項下對照品貯備液適量，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為五維賴氨酸顆粒加樣回收率試驗樣品溶液。精密量取賴氨肌醇維B12口服溶液0.2 ml，共9份，分別置于50 ml量瓶中，加入“2.1.1”項下對照品貯備液適量，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為賴氨肌醇維B12口服溶液加樣回收率試驗樣品溶液。取賴氨酸磷酸氫鈣片10片，研細(xì)，精密稱取約相當(dāng)于10 mg鹽酸賴氨酸的細(xì)粉，共9份，分別置于50 ml量瓶中，加入“2.1.1”項下對照品貯備液適量，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為賴氨酸磷酸氫鈣片加樣回收率試驗樣品溶度。按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并按外標(biāo)法以峰面積計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 3種復(fù)方制劑的加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery test of 3 compound preparations（n＝9）

2.8 樣品含量測定

取鹽酸賴氨酸對照品溶液與供試品溶液S1、S2、S3，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計算含量。同時，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法茚三酮比色法測定五維賴氨酸顆粒及賴氨酸磷酸氫鈣片中鹽酸賴氨酸的含量，按國家標(biāo)準(zhǔn)方法甲醛滴定法測定賴氨肌醇維B12口服溶液中鹽酸賴氨酸的含量。將HPLC法測定結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。由表2可知，HPLC法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定的結(jié)果一致，精密度有所提高。

表3 3種復(fù)方制劑的鹽酸賴氨酸含量測定結(jié)果比較（%）Tab 3 Comparison of lysine hydrochloride content of 3 compound formulations（%）

3 討論

3.1 衍生化方法的選擇

柱前衍生化HPLC法具有分析時間短、方法靈活多樣、靈敏度高的優(yōu)點，一直是分析化學(xué)領(lǐng)域探索的重要課題。OPA法為一種常用的衍生化方法，其缺點是OPA只能與一級氨反應(yīng)，不能同時檢測二級氨，使OPA-氨基酸的穩(wěn)定性差、需要及時進(jìn)樣；考慮到復(fù)方鹽酸賴氨酸制劑所含的氨基酸為一級氨，且其他主藥成分和輔料對衍生化的干擾較小，故選用反應(yīng)迅速、對儀器設(shè)備要求較低的、易于實現(xiàn)自動化的OPA法。OPA與硫醇試劑聯(lián)用，能與賴氨酸迅速反應(yīng)，產(chǎn)生具有高熒光強度的異吲哚衍生物，這些衍生物可以被熒光檢測器或紫外檢測器檢出[8]。考慮到本次樣品的質(zhì)量濃度在20μg/ml以上，故采用紫外檢測器。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

唐濤[9]曾以O(shè)PA及2，4-二硝基氟苯為衍生劑，考察了柱溫、衍生劑用量、反應(yīng)時間及流動相pH等因素對HPLC分析結(jié)果的影響。本文參考其色譜條件，確定了新的色譜條件：柱溫為35 Ⅰ，流動相pH為7.2，衍生劑比例為OPA-賴氨酸（50∶1，V/V）。由于OPA與賴氨酸的衍生物不穩(wěn)定，其峰面積會隨時間的延長而減小，故采用自動程序進(jìn)行衍生化，供試品與衍生劑精確混勻，準(zhǔn)確反應(yīng)2 min后立即進(jìn)樣分析。

利用二極管陣列檢測器對衍生產(chǎn)物進(jìn)行光譜掃描，提取衍生物紫外吸收圖譜，可見在231 nm和338 nm波長處有最大吸收。考慮到衍生劑在230 nm波長處有紫外末端吸收，會在色譜中形成雜峰，故選擇338 nm作為檢測波長。

3.3 不同測定方法對含量測定結(jié)果的影響

賴氨肌醇維B12口服溶液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用甲醛直接滴定鹽酸賴氨酸，通過pH的變化來指示終點；五維賴氨酸顆粒（片）、賴氨酸磷酸氫鈣片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用茚三酮比色法定量測定鹽酸賴氨酸的含量。這兩種方法各有優(yōu)缺點。甲醛滴定法操作簡單、成本低，當(dāng)樣品中只含有單一的已知氨基酸，則可由此法滴定的結(jié)果算出氨基酸的含量；但該反應(yīng)的終點依靠pH來顯示，根據(jù)堿的消耗量來計算賴氨酸濃度，誤差較大，且測試的誤差隨樣品濃度的降低逐漸增大，僅適合測定高濃度樣品[10]。茚三酮比色法是利用茚三酮與氨基酸反應(yīng)生成有色物質(zhì)，該物質(zhì)在565 nm波長附近有最大吸收，且吸收強度與氨基酸含量呈正比；但該方法受溶液pH、顯色劑用量、加熱時間和冷卻時間多重影響，精密度、重復(fù)性、專屬性均較差[11-12]。柱前衍生化HPLC法專屬性強、靈敏度高、重復(fù)性和準(zhǔn)確性均較好，將其所測得的鹽酸賴氨酸的含量結(jié)果與原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，基本一致，而精密度有所提高。因此，該方法可用于含有鹽酸賴氨酸的復(fù)方制劑的質(zhì)量控制。

[1]左云龍，王興勇.口服L-賴氨酸對小兒生長發(fā)育及營養(yǎng)影響的臨床研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2004，20（19）：1 960.

[2]國家藥典委員會編.WS-10001-（HD-0482）國家藥品標(biāo)準(zhǔn)：化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)：第5冊[S].2002：267.

[3]國家藥典委員會編.WS-10001-（HD-0304）國家藥品標(biāo)準(zhǔn)：化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)：第4冊[S].2002：23.

[4]國家藥典委員會編.WS-10001-（HD-0597）國家藥品標(biāo)準(zhǔn)：化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)：第7冊[S].2002：23.

[5]國家藥典委員會編.WS-10001-（HD-0596）國家藥品標(biāo)準(zhǔn)：化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)：第7冊[S].2002：20.

[6]國家藥典委員會編.WS-10001-（HD-0387）國家藥品標(biāo)準(zhǔn)：化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)：第4冊[S].2002：309.

[7]國家藥典委員會編.WS-10001-（HD-0388）國家藥品標(biāo)準(zhǔn)：化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)：第4冊[S].2002：313.

[8]陸明，孫黛妮，汪楊，等.OPA-FMOC聯(lián)用柱前衍生化法測定復(fù)方氨基酸注射液中氨基酸的含量[J].藥物分析雜志，2010，30（12）：2 323.

[9]唐濤.氨基酸柱前衍生化HPLC方法發(fā)展及應(yīng)用[D].南京：南京理工大學(xué)，2006：6.

[10]李春蘭，龐克堅，紀(jì)平山.甲醛酸堿法測定賴氨酸王漿口服液的含量[J].海峽藥學(xué)，1995，7（1）：85.

[11]劉飛飛，李群，于嵐.茚三酮比色法定量檢測鹽酸賴氨酸條件的研究[J].中國食品添加劑，2010，5（102）：223.

[12]崔敏，傅婕，遲原龍，等.茚三酮比色法和甲醛滴定法測定水解膠原的比較[J].中國皮革，2011，7（40）：1.