HPLC法測定藤梨根中異秦皮苷的含量

馬秉智，周宇，赫軍，趙鐵，李淑芳（中日友好醫院藥學部，北京 100029）

藤梨根為獼猴桃科植物中華獼猴桃Actinidia chinensis Planch.的干燥根，具有清熱解毒、活血散結、祛風利濕之功效，可用于治療風濕性關節炎、淋巴結結核、跌打損傷、癰癤等[1]。現代研究表明，其對胃癌、食管癌、肺癌、肝癌、大腸癌均有作用[2]。郭潔等[3]報道藤梨根提取物對人胃癌BGC-823細胞的增殖具有明顯抑制作用，在試驗濃度范圍內呈濃度依賴性，可促進細胞凋亡。孫春霞等[4]報道含有藤梨根的“化濁解毒方”可降低模型裸鼠血管內皮生長因子（VEGF）、環氧合酶-2（COX-2）的表達，聯合用藥療效更佳。關于藤梨根的質量標準研究，邸學等[5]對藤梨根藥材進行了高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜及質量研究，并測定了其中熊果酸、齊墩果酸的含量[6]，但是它們的含量均不超過0.1%。還有滕坤等[7]測定了藤梨根中大黃素的含量，但其含量僅為6.30μg/g。為此，筆者通過研究藤梨根的化學成分[8]，發現了其中一個含量較大的成分——異秦皮苷，而且是從獼猴桃科中首次分離得到。本研究將其作為質控指標，并采用HPLC法對藤梨根藥材進行含量測定，為藤梨根的質量控制提供科學依據。

1 材料

LC-10A型HPLC儀（日本島津公司）；BSA4235-CW電子天平（德國賽多利斯儀器系統有限公司）；KQ5200DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

異秦皮苷對照品（中日友好醫院自制，純度＞98%）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

藤梨根分別購自北京華邈中藥工程技術開發中心,產地:四川，產品批號:209061，生產日期:2012年9月6日；北京衛仁中藥飲片廠，產地:浙江，產品批號:113612101，生產日期:2012年6月4日；北京同仁堂（亳州）飲片有限責任公司，產地:河北，生產批號:001003287，生產日期:2010年9月6日。經中日友好醫院中藥庫唐永和藥師鑒定為獼猴桃科獼猴桃屬植物軟棗獼猴桃Actinidia chinensis Planch.的根。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18（250mm×4.6mm，5 μm），C18預柱（4.0mm×3.0mm）；流動相:乙腈-1%乙酸溶液（8∶92，V/V）；流速:1.0ml/min；檢測波長:350nm；柱溫:25 ℃；進樣量:10μl。色譜見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取異秦皮苷對照品9.90mg，置于50ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取樣品粉末1.0 g，精密稱定，置于100ml圓底燒瓶中，加入甲醇25ml，稱定質量，回流提取30min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 空白對照溶液的制備

精密移取甲醇25ml，置于100ml圓底燒瓶中，按供試品溶液的制備方法制成空白對照溶液。

2.5 線性關系考察

圖1 高效液相色譜圖A.空白對照；B.對照品；C.供試品；1.異秦皮苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.negative control；B.control；C.test sample；1.isofraxoside

分別精密移取對照品溶液0.5、1、2、4、8ml至10ml量瓶中，加甲醇定容。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線，得到異秦皮苷的回歸方程為y＝14893x+1289.5（r＝0.9999）。結果表明，異秦皮苷質量濃度在9.9～156.4μg/ml范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.6 精密度試驗

分別精密吸取同一異秦皮苷對照品溶液10μl，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積。結果，異秦皮苷峰面積的RSD為1.5%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

分別精密吸取同一供試品溶液10μl，分別于放置0、2、4、6、8、10、12h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，異秦皮苷峰面積的RSD為1.3%，表明供試品溶液在12h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

分別取同一樣品（批號:001003287）適量，共6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，異秦皮苷含量的RSD為1.0%，表明本方法重復性較好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的河北產藤梨根樣品（批號:001003287）約0.50 g，共6份，分別加入一定量的異秦皮苷對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

2.10 樣品含量測定

分別取不同產地的3批樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，以外標法計算樣品中異秦皮苷的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2 Results of content determination（n＝3）

3 討論

3.1 提取方法的選擇

筆者考察了甲醇超聲提取10、20、30min和甲醇回流提取30、60min 5種提取方法。結果發現，甲醇回流提取30min，測得的異秦皮苷的含量最高，故最終確定甲醇回流提取30min作為本研究的提取方法。

3.2 檢測波長的選擇

分別將異秦皮苷對照品溶液在200～800nm波長范圍內作全波長掃描，發現其在350nm波長下有最大吸收，因此選擇350nm作為本研究的檢測波長。

3.3 流動相的選擇

分別將甲醇-1%醋酸、甲醇-1%甲酸、乙腈-1%醋酸作為流動相，按不同比例進行研究。最終發現，采用乙腈-1%醋酸（8∶92，V/V）為流動相時，基線平穩，峰形、分離度效果較佳。

3.4 關于異秦皮苷的研究

筆者查閱近年來國內外文獻發現，有關異秦皮苷的報道[9]很少，且主要是化學成分方面的研究。但是，它是否具有藥理活性、是否是藤梨根的活性成分，尚有待于進一步研究。

[1]北京市藥品監督管理局.北京市中藥飲片炮制規范:2008年版[S].北京:化學工業出版社，2008:107.

[2]龍凱花，王小平，白吉慶，等.中藥藤梨根抗腫瘤研究[J].中國現代中藥，2013，15（10）:846.

[3]郭潔，王小平，白吉慶.藤梨根提取物對人胃癌BGC細胞凋亡及Bax蛋白表達的影響[J].亞太傳統醫藥，2014，10（13）:12.

[4]孫春霞，李佃貴，閆翠環，等.化濁解毒方對裸鼠人胃癌原位移植瘤VEGF與COX-2的影響[J].中國藥房，2012，23（19）:1735.

[5]邸學，王海波，楊欣欣，等.藤梨根藥材HPLC指紋圖譜及質量研究[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（10）:135.

[6]邸學，王海波，翟延君，等.HPLC測定藤梨根中熊果酸、齊墩果酸的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（1）:66.

[7]滕坤，于思文.高效液相色譜法測定藤梨根中大黃素的含量[J].通化師范學院學報:自然科學版，2014，35（3）:42.

[8]赫軍，馬秉智，趙鐵，等.藤梨根的化學成分研究[J].中國藥學雜志，2014，49（3）:184.

[9]劉宏偉，姚新生，王乃利，等.長柄七葉樹的化學成分[J].中國天然藥物，2005，3（6）:350.