氧化苦參堿聯合順鉑對SKOV3人卵巢癌細胞的作用

王東暉 劉丹彤 高潔凡 王曉紅 史春燕

氧化苦參堿聯合順鉑對SKOV3人卵巢癌細胞的作用

王東暉 劉丹彤 高潔凡 王曉紅 史春燕

目的 探討氧化苦參堿聯合順鉑對卵巢癌SKOV3細胞增殖及凋亡的影響。方法 MTT法檢測氧化苦參堿2.5 mg/ml、5.0 mg/ml、10.0 mg/ml三個劑量聯合順鉑3 μg/ml對細胞增殖的影響;流式細胞術檢測氧化苦參堿聯合順鉑對SKOV3細胞周期及凋亡率的影響;Western blot法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 。結果 與順鉑組相比，氧化苦參堿3個劑量均能不同程度抑制SKOV3細胞增殖，5.0 mg/ml、10.0 mg/ml 2個劑量與順鉑組比較，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，抑制率與氧化苦參堿濃度正相關。氧化苦參堿能增強順鉑對細胞周期的影響作用，與順鉑組比較G0/G1期細胞顯著增多(P＜0.05或P＜0.01);同時，氧化苦參堿聯合順鉑組較順鉑組細胞凋亡率有所升高，10.0 mg/ml劑量組與順鉑組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。氧化苦參堿3個劑量均能不同程度下調Bcl-2蛋白表達，5.0 mg/ml、10.0 mg/ml 2個劑量與順鉑組比較，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01);氧化苦參堿3個劑量均能不同程度上調Bax蛋白表達調，10.0 mg/ml劑量組與順鉑組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。結論 氧化苦參堿具有增強順鉑對卵巢癌SKOV3細胞增殖的抑制作用，并對細胞凋亡有促進作用，下調Bcl-4、上調Bax蛋白表達為其促凋亡機制之一。

卵巢癌;氧化苦參堿;順鉑;細胞凋亡

卵巢癌是嚴重威脅女性生命的惡性腫瘤，目前臨場常用治療手段主要是手術和化療，而鉑類是卵巢癌化療方案中最常用的藥物，但是腫瘤細胞對鉑類的耐藥性及其毒副作用往往導致化療方案難以順利實施。因此，尋找對化療藥物具有減毒或增效作用的輔助用藥非常必要。氧化苦參堿是從豆科植物苦參中提取分離的一種生物堿，它的抗腫瘤活性受到了廣泛關注并進行了大量的機制研究［1，2］。本課題通過分析氧化苦參堿與順鉑聯合用藥的卵巢癌細胞的影響，為其臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌SKOV3細胞，購于吉妮歐生物科技公司。氧化苦參堿注射液購于正大天晴制藥公司。四甲基偶氮唑藍(MTT)為Sigma公司產品。Annexinv-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，購于上海碧云天生物技術研究所。Bcl-2、Bax一抗購于Abcam美國公司。Epics XL流式細胞儀，Beckman Coulter公司。SpectraMax M2酶標分析儀，Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:將卵巢癌SKOV3細胞用含10%胎牛血清的1640培養基，在37℃、5%CO2培養箱內無菌培養。細胞融合80%左右時，0.25%胰酶消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 細胞分組:將SKOV3細胞分為空白對照組(A)、順鉑組(B)、順鉑與氧化苦參堿聯用三個劑量組(C、D、E)，順鉑終濃度為 3 μg/ml，氧化苦參堿三個濃度分別為 2.5 mg/ml、5.0 mg/ml、10.0 mg/ml，每組 10個復孔。

1.2.3 MTT法檢測氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細胞增殖的影響［3］:取對數生長期細胞，胰酶消化，臺盼藍計數，調整細胞濃度為5×106個/ml，每孔加細胞懸液 200 μl，置 37℃、5%CO2培養箱培養 24 h 后，分別加入相應藥物，空白對照組加入等量培養基。加藥48 h后，加入MTT 20 μl(濃度為2 g/L)，置培養箱中繼續培養，時間為4 h，甩棄細胞培養基，每孔加入200 μl DMSO(二甲基亞砜)，置震蕩器上震蕩1 min，使藍色晶體完全溶解后，用酶標儀于570 nm處檢測吸光度(OD值)，并計算抑制率:抑制率=(空白對照組OD值-用藥OD值)/空白對照組OD值×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細胞周期的影響［4］:取對數生長期細胞，胰酶消化，臺盼藍計數，調整細胞濃度為5×106個/ml，按5 ml/瓶移至無菌培養瓶中，每組6瓶，培養24 h后加藥，空白對照組加入等量培養基。加藥后繼續培養48 h。胰酶消化，收集細胞，PBS清洗2遍，然后用70%乙醇溶液于4℃冰箱進行固定，時長2 h，PI避光染色30 min后，300目尼龍網過濾，流式細胞儀進行檢測，以cxp Analysis軟件分析細胞周期及凋亡率。

1.2.5 Western blot法檢測氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響:細胞常規培養，加藥作用48 h后，胰酶消化，收集細胞，將細胞裂解后收集蛋白，考馬斯亮藍法進行蛋白定量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。將封閉后的硝酸纖維素膜置入TTBS稀釋(1∶500)的一抗溶液/β-actin(1∶1 000)稀釋液，4℃緩慢搖動過夜。洗膜后，將膜置入適量以TTBS 1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗溶液中，于室溫反應2 h。洗膜后抗體結合區帶用化學發光法檢測。將膠片掃描，Labworks軟件下對條帶進行吸光度積分掃描，以β-actin作為內參照，用目的蛋白灰度值/β-actin內參照膠片灰度值的比值為蛋白的相對表達量，進行統計分析。

2 結果

2.1 氧化苦參堿聯合順鉑對SKOV3細胞增殖的影響MTT比色法顯示，氧化苦參堿與順鉑聯合應用能夠抑制SKOV3細胞增殖，且能增強順鉑的抑制作用，其中氧化苦參堿5.0 mg/ml、10.0 mg/ml 2個劑量組與順鉑組比較，差異有統計學意義(P＜0.05或0.01)。見表1。

表1 氧化苦參堿聯合順鉑對SKOV3細胞增殖的影響n=10，±s

表1 氧化苦參堿聯合順鉑對SKOV3細胞增殖的影響n=10，±s

注:與A組比較，*P ＜0.01;與B組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 OD值 抑制率(%)A組0.833±0.062 0 B組 0.657±0.041* 21.13 C組 0.621±0.053* 25.45 D組 0.608±0.044*# 27.01 E組 0.579±0.057＊△30.49

2.2 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細胞周期的影響與空白對照組比較，各用藥組G0/G1期細胞均增多(P＜0.01)，且氧化苦參堿3個劑量均能增強順鉑的作用(P＜0.05或P＜0.01);與空白對照組比較，S、G2/M期細胞均減少，其中G2/M期細胞減少尤為明顯(P ＜0.01)，氧化苦參堿 5.0 mg/ml、10.0 mg/ml組與順鉑組相比明顯降低(P＜0.05或P＜0.01);與空白對照組比較，各用藥組SKOV3細胞均顯著升高(P＜0.01)，而氧化苦參堿10.0 mg/ml組較順鉑組升高尤為明顯(P＜0.05)。見表2。

表2 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細胞周期的影響n=6，%，±s

表2 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細胞周期的影響n=6，%，±s

注:與A組比較，*P ＜0.01;與B組比較，#P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 G0/G1 S G2/M 凋亡率A組 47.28±5.73 39.72±4.65 13.01±1.96 3.21±0.54 B組 56.49±3.92* 36.03±4.02 7.48±1.21* 28.26±5.73*C組 63.72±6.05＊△ 30.97±4.11* 5.31±1.41*# 30.82±6.16*D組 65.14±5.22＊△ 29.72±3.69*# 5.14±1.33＊△ 34.73±5.92*E組 68.28±7.03*# 26.97±4.26＊△ 4.75±1.11＊△ 38.28±6.74*#

2.3 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 與空白對照組比較，各用藥組Bcl-2蛋白表達均顯著下調(P ＜0.05或P ＜0.01)，而Bax蛋白表達均顯著上調(P＜0.05或P＜0.01);與順鉑組比較，氧化苦參堿5.0 mg/ml、10.0 mg/ml組 Bcl-2蛋白表達顯著下調(P＜0.05或P＜0.01)，氧化苦參堿10.0 mg/ml組Bax蛋白表達顯著上調(P＜0.05)。見表3。

表3 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細胞Bcl-2、Bax相對蛋白表達量的影響n=3，±s

表3 氧化苦參堿對順鉑處理SKOV3細胞Bcl-2、Bax相對蛋白表達量的影響n=3，±s

注:與A組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01;與B組比較，△P ＜0.05，☆P ＜0.01

組別Bcl-2 Bax A組0.67±0.03 0.36±0.04 B組 0.55±0.04* 0.48±0.05*C組 0.52±0.03# 0.53±0.05#D組 0.43±0.04#△ 0.58±0.06#E組 0.40±0.03#☆ 0.61±0.04#△

3 討論

MTT法常用于大規?？鼓[瘤藥物的篩選、腫瘤細胞放化療敏感性測定等，靈敏度高，經濟。它的結果反映的是存活細胞的數量，但另一個方面，它又反映了藥物對腫瘤細胞增殖、凋亡、死亡的綜合效應。結果顯示，順鉑有效抑制了卵巢癌SKOV3細胞的生長，氧化苦參堿聯合用藥組對腫瘤細胞的抑制作用更為明顯，效果優于單用順鉑組，且存在明顯的劑量依賴關系。

細胞凋亡(apoptosis)是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡，是機體清除衰老、損傷、突變細胞的重要方式。目前，很多學者認為細胞凋亡受抑是腫瘤發生的重要原因，而誘導細胞凋亡已經成為腫瘤治療的新靶標。迄今為止，國內外眾多科研人員借助分子生物學技術，就細胞凋亡做了大量的探索工作，提出了很多觀點和假說，但是仍然沒有找到有關細胞凋亡過程的確切機制［5，6］。有研究表明，細胞凋亡和細胞周期有相關性，細胞周期阻滯于哪一期，凋亡就發生在哪一期［7，8］。細胞周期分為間期和分裂期兩個階段，細胞大部分生命活動時間是在間期度過的。間期又分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)。細胞增殖周期能否順利進行，主要取決于G1/S轉換盒G2/M轉換，這是調控細胞周期進程的2個節點。本研究結果表明，順鉑能過將卵巢癌SKOV3細胞阻滯于G0/G1期，使得進入S期的細胞比例有所降低。氧化苦參堿能夠增強順鉑對卵巢癌SKOV3細胞的阻滯作用，并且隨濃度增高，G0/G1期細胞比例逐漸升高，S期細胞比例顯著降低，故我們推測，細胞凋亡主要發生在G1期。凋亡的發生過程受到多種基因的調控，目前研究較多的有p53、caspase、Bcl-2等。Bcl-2是抗細胞凋亡蛋白的代表，Bax是促細胞凋亡的代表，兩者相互拮抗，二者平衡時細胞正常生長［9］。隨著氧化苦參堿濃度的上升，Bcl-2蛋白表達逐漸降低，而Bax蛋白表達明顯升高，細胞凋亡率也隨之升高，故我們推測氧化苦參堿誘導的SKOV3細胞凋亡與Bcl-2、Bax蛋白表達失衡有關。

順鉑作為卵巢癌常用化療藥物，腫瘤細胞產生的耐藥性以及藥物本身的毒副反應為臨床應用造成了一定障礙，本研究對氧化苦參堿用于卵巢癌化療輔助用藥有一定的參考價值，但仍然存在缺陷，如只觀察了藥物對卵巢癌SKOV3一個時間點作用效果，未進行動態觀察來評價藥物作用與時間的關系，程度如何;順鉑只設一個劑量組，未進行氧化苦參堿能否降低順鉑IC50值的相關研究等，這些我們將在后續研究中進行完善。另外，氧化苦參堿對耐藥卵巢癌細胞株的作用、對其他卵巢癌細胞株的作用等一系列研究等待我們開展。我們將通過大量的研究工作來觀察氧化苦參堿能否在不影響療效的前提下降低化療藥物用量，增強化療效果，或增加腫瘤對化療藥物的敏感性。

1 周喜漢，韋星，黃贊松，等.苦參堿對結腸癌sw1116細胞增殖及端粒酶活性的影響.中藥材，2009，32:923-925.

2 Ling Q，Xu X，Wei X，et al.Oxymatrine induces human pancrealic cancer PANC-1 cells apoptosis via regulating expression of Bcl-2 and LAP families，and releasing of cytochrome.Exp Clin Cancer Res，2011，30:66.

3 司徒鎮強，吳軍正主編.細胞培養.第1版.西安:世界圖書出版公司，1996.186-187.

4 郭啟帥，黃曦，李少林.苦參堿誘導卵巢癌SKOV3細胞凋亡的機制研究.中國藥理學通報，2010，26:1104-1107.

5 Fan TJ，Han LH，Cong RS，et al.Caspase family protease and apoptosis.Acta Biochim Biophys Sin，2005，37:719-727.

6 Yamashita S，Masuda Y，Kurizaki T，et al.Survivin expression predicts early recurrence in early-stage breast cancer.Anticancer Res，2007，27:2803-2808.

7 姜浩，樊光華.人參皂甙-Rh2對人肝癌Bel-7404細胞增殖和凋亡的影響.中國腫瘤臨床與康復，2004，11:289-292.

8 Basu A，Haldar S.The relationship between Bcl2，Bax and p53:consequences for cell cycle progression and cell death.Mol Hum Report，1998，4:1099-1109.

9 Cory S，Huang DC，Adams JM.The Bcl2 family:roles in cell survival and oncogenesis.Oncogene，2003，22:8590-8607.

R 737.31

A

1002-7386(2015)23-3556-03

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．011

061001 河北省滄州市中心醫院(王東暉、劉丹彤、高潔凡、史春燕);河北省泊頭市婦幼保健醫院(王曉紅)

2015-06-10)