結直腸癌16層螺旋CT灌注成像與腫瘤血管生成相關性分析

尹蘭英 李慶嘯 李彩英 韓帥 張鐵亮

結直腸癌16層螺旋CT灌注成像與腫瘤血管生成相關性分析

尹蘭英 李慶嘯 李彩英 韓帥 張鐵亮

目的 研究結直腸癌MSCT血流灌注成像參數與微血管密度、促血管生成素2(Ang-2)、血管內皮生長因子(VEGF)表達之間的相關性，探討結直腸癌灌注成像與腫瘤血管生成的關系。方法 對25例結直腸癌患者進行螺旋CT灌注成像檢查，螺旋CT灌注的參數包括血流量(BF)、血容量(BV)、平均通過時間(MTT)和表面通透性(PS)。術后采用免疫組化方法測定癌組織的MVD、VEGF和Ang-2的表達，對CT灌注參數與癌組織的MVD、VEGF和Ang-2表達進行相關性分析。結果 結直腸癌中MVD與VEGF表達呈正相關(P＜0.05)。直腸癌MSCT血流灌注參數與MVD、VEGF、Ang-2無明顯相關性(P＞0.05);在VEGF陰性組中，BV值顯著高于陽性組(P ＜0.05)。結論 多層螺旋CT灌注成像與VEGF和Ang-2均能反映結直腸癌的血管生成狀況，但它們之間無明顯相關性。

結直腸癌;CT灌注成像;微血管密度;促血管生成素;血管內皮生長因子

直腸癌是我國常見的消化道腫瘤，死亡率居第二位。在腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移過程中，腫瘤新生血管起到了非常重要作用。促血管生成素(angiopoietin，Ang)-2與血管內皮生長因子 (vascular endethelial growth factor，VEGF)協同參與了腫瘤新生血管的調控［1］。MSCT灌注成像技術可用于間接評估腫瘤血供與血管生成情況［2］。本研究擬探討結直腸癌CT灌注成像與MVD及VEGF、ANG-2之間的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對2009年1月至2012年12月結直腸癌25例患者，其中男13例，女12例;年齡29～80歲，平均年齡59.76歲;術前行MSCT灌注成像，手術病理均為腺癌，腫瘤位于直腸20例，結腸5例;按TNM標準，T2期7例，T3期13例，T4期5例;高分化12例，中低分化13例。掃描和手術前所有患者未做過任何針對腫瘤治療;無碘對比劑過敏;無嚴重的心、肺、肝、腎疾病。

1.2 掃描前準備 檢查前清潔腸道，檢查前1 h飲水充盈膀胱，掃描前10～15 min肌內注射鹽酸山莨菪堿10 mg，上檢查床后，經肛門注入溫水600～800 ml，盡量使腸管擴張，患者有不適時即停止灌注。

1.3 掃描及后處理 采用GE Lightspeed 16層螺旋CT進行平掃，范圍自臍水平至恥骨聯合下緣，針對直腸腫瘤最大層面行灌注掃描，造影劑:非離子型碘對比劑(碘佛醇40 ml)，高壓注射器經肘前靜脈注射，4 ml/s，注藥開始延時10 s行灌注成像，采集4層，掃描間隔0.5 s。掃描完成后將數據傳輸到GE工作站，選取流入靶動脈及流出靶靜脈.通過灌注軟件計算出CT灌注圖像。選擇腫瘤強化最明顯的層面作為感興趣區(region of interest，ROI)。ROI選取盡量大范圍，以減少量子噪聲及部分容積效應。避開腫瘤的邊緣區域以及腫瘤內部肉眼可見的壞死、液化、囊變及血管等，以避免部分容積效應的影響。ROI劃定后軟件自動生成靶動脈、腫瘤等各個ROI的TDC以及反映腫瘤血流灌注狀態的灌注參數值 BF、BV、MTT、PS。所得圖像均以彩色顯示，以突出病變區域的對比，然后重復測量，取其平均值作為該病例灌注值，最后進行定量，半定量分析和數據統計分析。獲取灌注參數數值及灌注圖，包括:(1)灌注血容量(blood volume，BV):存在于一定量組織血管結構內的血容量(ml/100 g/min);(2)血流量(blood flow，BF):在單位時間內流經一定量組織血管結構的血流量(ml/100 g);(3)平均通過時間(mean transit time，MTT):指血液流經血管結構時(包括動脈、毛細血管、靜脈竇和靜脈)所經過的不同路徑的平均時間，主要反映對比劑通過毛細血管的時間(s);(4)表面通透性(permeability surface area product，PS):指單位時間一定量組織血管內對比劑由毛細血管內皮擴散到細胞間隙的單向傳輸速率率(ml/100 g/min)。

1.4 病理學及免疫組織化學染色檢查 免疫組織化學標本組織取材盡可能與CT單層動態掃描層面一致。經乙醛固定，常規石蠟包埋備用。染色步驟按SP試劑盒提供的說明書進行。采用免疫組織化學SP法檢測對腫瘤組織測定MVD數量及VEGF、Ang-2的表達情況。以腫瘤組織內孤立的棕黃色血管內皮細胞或細胞簇代表一條單獨的血管，在低倍鏡下挑選微血管密度最高的區域，然后在400倍視野下計數10個視野中被CD34染成棕黃色的血管密度，取其中最大值的平均值作為MVD。VEGF與Ang-2染色按照標準［3］評分，A以著色細胞占視野細胞總數的多少評分。A為陽性細胞數分級，評分0～4級，無染色細胞=0，1%～10%細胞染色=1，11% ～50%細胞染色=2，51% ～80%細胞染色=3，81% ～100%細胞染色=4。B為陽性細胞顯色強度，評分0～3級，陰性=0、弱陽性=1、陽性=2、強陽性=3。先在低倍鏡下掃視整個切片，選擇3個陽性細胞分布較密集的區域，換高倍鏡再觀察3個視野。IHS=A×B積分數=A×B。A×B=0為(-)，A×B=1～4為(+)，A ×B=5～8判斷為(++)，A×B=9～12判斷為(+++)。為簡化處理，以(-)(+)為陰性表達，(++)(+++)為陽性表達。

1.5 統計學分析 應用SPSS 13.0統計軟件，正常對照組與直腸癌CT灌注之間采用t檢驗;直腸癌CT灌注參數與VEGF、Ang-2表達強度之間關系采用person相關性檢驗;MVD與 VEGF、Ang-2表達強度之間，VEGF與Ang-2表達強度之間強度分別做Spearman相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 直腸癌微血管密度與血管生成因子的關系 本組25例結、直腸癌中，VEGF染色陽性15例，陰性10例。ANG-2染色陽性10例，陰性15例。直腸癌MVD數量與VEGF表達呈正相關(r=0.568，P＜0.05)，且在VEGF陽性表達組中，MVD數目明顯高于低表達組(P＜0.05);但Ang-2與MVD無明顯相關性(P＞0.05)，Ang-2陽性表達組中MVD與陰性表達組差異無統計學意義(P＞0.05);VEGF與Ang-2表達強度不具有相關性(P＞0.05)，Ang-2略高于陰性組VEGF陽性組Ang-2高于陰性組，但差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 MSCT血流灌注參數與MVD、Ang-2和VEGF之間相關性

2.2 直腸癌灌注參數與腫瘤血管生成的關系 直腸癌灌注參數與MVD、VEGF、Ang-2表達之間均不具有相關性(P＞0.05)，但VEGF陰性表達組BV值高于陽性表達組(P＜0.05)，余灌注參數在不同血管生成因子表達強度下差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2、3。

3 討論

腫瘤的生長依賴血管生成，新生血管在腫瘤生長或轉移過程中起重要作用。腫瘤新生血管的形成為腫瘤生長提供氧和營養物質，同時也為腫瘤細胞的擴散和轉移提供了條件［4］。其中VEGF與 Ang是最主要的腫瘤血管生長調節因子［5］。在食管癌、胃癌、子宮內膜癌、肝癌等腫瘤組織中，Ang-2、VEGF表達均明顯高于癌旁組織，認為其過度表達促進了腫瘤的血管生成和進展，在腫瘤的侵襲和轉移中起到了重要作用。在結直腸癌組織中，Ang-2、VEGF的表達水平與腫瘤分期、浸潤程度、淋巴結轉移、遠處轉移、以及生存率密切相關。VEGF促進內皮細胞分化增殖，形成原始血管，是新生血管生成的主要因素［6］，本研究結果亦示直腸癌 MVD與 VEGF呈正相關(r=0.568，P＜0.05)。VEGF是腫瘤血管生成的主要調控者，在多種人類腫瘤中均過度表達［7］。Ang則促進血管成熟，維持血管穩定，并參與生理或病理情況下的血管新生。Ang主要包括Ang-1及Ang-2，其中Ang-2被認為是Ang-1的天然拮抗劑。Ang-2只在正常成人血管網重塑過程中表達，協助Ang-1維持血管穩定。在正常成人組織中，Ang-2僅表達于血管重建部位，其他正常成熟組織中無表達或僅有微弱表達，Ang-2表達增高被認為是腫瘤侵及血管的早期標志［8］其過度表達導致腫瘤血管生成，腫瘤生長加快［9］。腫瘤的血管生成主要取決于血管生成促進因子和抑制因子的嚴密調節，VEGF與Ang在血管的發育過程中發揮了互補與協調的作用。本研究中兩種血管生成因子無明顯相關性(P＞0.05)，雖然VEGF陽性組Ang-2表達高于陰性組，但差異無統計學意義(P＞0.05)，表明兩種血管生成因子在血管生成中起不同作用，Ang-2與VEGF可不同時表達，但 VEGF能上調 Ang-2的表達，當VEGF存在時，Ang-2拮抗Ang-1有促血管結構穩定的作用，誘導內皮細胞分裂、移位，使新生血管生長;當VEGF缺乏時，Ang-2抑制 Ang-1則誘導血管發生退化，數目減少，內皮細胞發生凋亡［10］。

表2 不同表達強度ANG-2下直腸癌灌注參數、MVD、VEGF值±s

表2 不同表達強度ANG-2下直腸癌灌注參數、MVD、VEGF值±s

MVD VEGF陰性(n=15) 82.98±35.37 6.62±2.29 8.04±4.17 17.07±6.41表達情況 BF(ml/100 g/min) BV(ml/100 g) MTT PS(ml/100 g/min)25.67±14.26 5±2.70陽性(n=10) 70.57±35.00 4.96±2.27 7.47±2.47 16.48±5.63 28.4±17.81 6.6±2.59 t值0.865 1.779 0.388 0.236 -0.305 -1.475 t值0.397 0.088 0.702 0.815 0.77 0.154

表3 不同表達強度VEGF下直腸癌灌注參數、MVD、ANG-2值±s

表3 不同表達強度VEGF下直腸癌灌注參數、MVD、ANG-2值±s

MVD Ang-2陰性(n=10) 90.55±40.73 7.26±2.72 8.77±4.49 17.42±6.71表達情況 BF(ml/100 g/min) BV(ml/100 g) MTT PS(ml/100 g/min)15.38±10.31 4±2.26陽性(n=15) 69.66±29.19 5.08±1.718 7.17±2.72 16.44±5.69 32.22±15.60 5.67±2.44 t值1.497 2.454 1.115 0.393 -2.588 -1.722 t值0.148 0.022 0.277 0.698 0.021 0.099

自Miles在1991年首次提出 CT灌注成像(CT perfusion imaging，CTPI)概念以來，CT技術也在飛速發展，目前多層螺旋 CT灌注成像技術現已成為腫瘤診斷及治療學研究等的熱點。CT灌注成像技術被認為可以反應活體腫瘤微血管狀況，有學者研究發現直腸腫瘤 BF值 (60.33±29.13)明顯高于正常組織(31.02±15.55)，而平均通過時間 MTT值(9.51±4.43)卻較正常直腸組織(16.98±4.27)明顯縮短，認為CT灌注成像能夠有效區分腫瘤與正常直腸組織［11］。與 本 組 結 果 BF(78.02 ± 35.04)、MTT(7.81±3.54)相近。也有報道認為直腸癌BF值能夠有效評價腫瘤分期及預后［12］。腫瘤CT灌注本質便是研究腫瘤的血流特點，血管成因子是腫瘤新生血管的主要因素［13］。本組研究結果認為直腸癌灌注參數與血管內皮生長因子無明顯相關性，與國內外研究結論相同［14，15］。直腸癌灌注參數與 Ang-2之間相關性研究，國內外尚未見報道，本研究示兩者亦無明顯相關性。提示CT灌注與血管因子反應的是腫瘤血管生成的不同方面。本研究結果示灌注參數與MVD、VEGF均無相關性。但在VEGF陰性表達組中，BV值顯著高于陽性組(P＜0.05)。本研究結果示VEGF低表達時直腸癌血容量高于高表達組。VEGF表達增高，MVD增高，灌注量反而降低，提示灌注量與MVD之間存在不一致性。彭李青等［16，17］研究認為腫瘤生長方式、組織區壓力增高等均可導致血流灌注減低，血流灌注減低又反過來加重組織缺血缺氧。缺血缺氧均是導致VEGF高表達的原因［18］。反復加重的缺血缺氧導致VEGF高表達，VEGF高表達致使微血管增生，間質壓力亦隨之增高，灌注量卻并未增加甚至反而降低，因此BV值降低。并且腫瘤可建立動靜脈短路，血流不通過毛細血管;腫瘤的新生血管結構不完整，而灌注反應的是腔化有功能血管血流量［19］。

綜上所述，本研究示結直腸癌的灌注參數與VEGF、Ang-2因子均可以反應直腸癌腫瘤血管生成，但兩者之間無明顯相關性。MVD、VEGF、Ang-2只從手術切除標本上測得，且是一種有創性、不可重復性的檢查，計數結果受所使用的標記物、視野的大小的影響。因此臨床迫切需要一種能在術前可靠評估腫瘤血管生成的檢查方法，CT灌注成像即可以在活體情況下評價腫瘤動態血運狀況，又可以反映大體形態變化，綜合評價腫瘤情況。因此CT灌注成像技術評價直腸癌微循環狀況具有潛在優勢，作為一種前瞻、可重復的檢查方式，CT灌注可以很好的反應活體直腸癌微血管情況，但灌注參數對血管生成因子的評價和意義尚有待進一步研究。

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R 735.37

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1002-7386(2015)23-3607-04

10．3969/j．issn．1002-7386．2015．23．030

050000 石家莊市，河北醫科大學第二醫院影像科

李彩英，050000 石家莊市，河北醫科大學第二醫院;E-mail:licaiying63@163.com

2015-04-17)