鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)分化與增殖試驗

石麗敏，盧華兵，胡賢女

(浙江省東陽玉米研究所，浙江東陽 322100)

鐵皮石斛 (Dendrobium officinale)，又名黑節(jié)草，為蘭科石斛屬植物，是傳統(tǒng)名貴中藥材，具有益胃生津、滋陰清熱、止咳潤肺的功效。現(xiàn)代藥理研究表明，石斛還具有抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力和擴(kuò)張血管的作用。鐵皮石斛蒴果成熟時易開裂，且種子粒徑小，自然繁殖率低。由于鐵皮石斛生長條件的特殊性和分布的局限性以及多年的人為過度采挖破壞，自然資源瀕臨枯竭，成為瀕危植物，被列為國家重點保護(hù)的野生藥材品種。因此，為了保護(hù)和有效利用鐵皮石斛，采用組織培養(yǎng)技術(shù)，大量快速繁殖鐵皮石斛組培苗顯得尤為重要。以鐵皮石斛種子誘導(dǎo)原球莖，再通過原球莖的分化、增殖培養(yǎng)而得到大量幼苗，這種快繁方法可加快鐵皮石斛繁殖速度，推進(jìn)工廠化育苗。筆者以鐵皮石斛種子為外植體進(jìn)行了鐵皮石斛原球莖誘導(dǎo)與增殖的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試鐵皮石斛的成熟蒴果 (種齡5個月以上)采于浙江省東陽玉米研究所塘西試驗基地。

1.2 方法

采集鐵皮石斛成熟蒴果，經(jīng)過表面消毒處理，剖開蒴果取出種子接種到原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時間的誘導(dǎo)，種子膨大產(chǎn)生原球莖并分化成小苗，將分化形成的小苗轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。基本培養(yǎng)基:MS+7.0 g·L-1瓊脂+30 g·L-1蔗糖+0.5%活性炭，pH值5.8。培養(yǎng)條件:溫度 (25±1)℃，光強(qiáng)為2 000 lx，光照時間12 h·d-1。

1.2.1 外植體的消毒處理

將鐵皮石斛的蒴果先用自來水沖洗干凈，再置于洗潔精溶液中搖洗10 min，取出蒴果用自來水洗凈，瀝干水后，在超凈工作臺上先用75%的酒精消毒2 min;倒去酒精，再用0.1%的升汞消毒15 min;倒去升汞消毒液，用無菌水沖洗4～5次，瀝干備用。接種時，將經(jīng)過表面消毒的蒴果放在無菌的不銹鋼盤上，切除頭尾約0.5 cm，然后將蒴果中段沿縱軸切開，取出種子，均勻地接種到培養(yǎng)基表面。

1.2.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度為 (25±2)℃，以日光燈為光源，光照強(qiáng)度為2 000～2 500 lx，每天照光12 h。

1.2.3 原球莖的誘導(dǎo)與分化

以MS和1/2 MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置8個處理，分別添加不同濃度的NAA，試驗設(shè)計見表1。將種子接種在原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每處理接種5皿，接種后的培養(yǎng)皿先遮光培養(yǎng)10 d后，再進(jìn)行光培養(yǎng)。40 d后統(tǒng)計原球莖的誘導(dǎo)情況，90 d后調(diào)查幼苗分化情況。

1.2.4 幼苗增殖

以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置6個處理，分別添加不同濃度的NAA。將原球莖分化出的幼苗轉(zhuǎn)接到幼苗增殖培養(yǎng)基中，每個處理接種10瓶，每瓶接種25株。90 d后調(diào)查統(tǒng)計幼苗增殖情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 原球莖誘導(dǎo)與分化

接種10 d左右，種子開始萌發(fā)變綠，40 d左右可明顯看到膨大的原球莖，且部分原球莖開始分化出芽尖。90 d左右可明顯看到分化出的小苗。

試驗中發(fā)現(xiàn)，不同處理上種子均可萌發(fā)誘導(dǎo)出原球莖，可知在培養(yǎng)基中不添加或者添加低濃度的NAA可促進(jìn)種子的萌發(fā)。

由表1可以看出，以MS為基本培養(yǎng)基的處理原球莖誘導(dǎo)率均高于以1/2MS為基本培養(yǎng)基的處理。在激素配比試驗中可看出，處理1，2的原球莖誘導(dǎo)率最高為100%，處理8的誘導(dǎo)率最低為20%。

表1 不同激素配比對原球莖誘導(dǎo)及分化的影響

處理2的幼苗分化率最高為99%，處理1，6次之，為90%。處理4，8的幼苗分化率最低，為5%。由此可以看出，高濃度NAA抑制幼苗分化，低濃度NAA促進(jìn)幼苗分化。

綜合原球莖誘導(dǎo)和分化情況可知，MS中添加0.1 mg·L-1NAA可有效促進(jìn)鐵皮石斛種子萌發(fā)和發(fā)育。

2.2 幼苗增殖

由表2可以看出，不同處理培養(yǎng)基上幼苗均能增殖，增殖系數(shù)隨著NAA濃度增加而變大，處理4當(dāng)NAA濃度為0.22 mg·L-1時，增殖系數(shù)最大，為3.8;隨著NAA濃度進(jìn)一步增加，增殖系數(shù)逐漸變小。處理3幼苗生長較整齊，苗較高，根系比較旺盛;處理4幼苗短小而粗壯，苗勢較好。綜合幼苗增殖和生長情況可知，MS中添加0.15～0.20 mg·L-1NAA可有效促進(jìn)鐵皮石斛幼苗增殖和生長。

表2 不同NAA濃度對幼苗增殖的影響

3 小結(jié)與討論

通過接種成熟種子對原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選發(fā)現(xiàn)，在MS+0.1 mg·L-1NAA+7.0 g·L-1瓊脂+30 g·L-1蔗糖+0.5%活性炭上，鐵皮石斛成熟種子能順利萌發(fā)誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，并自然分化形成幼苗。在MS+0.15～0.2 mg·L-1NAA+7.0 g·L-1瓊脂+30 g·L-1蔗糖+0.5%活性炭上，幼苗能快速進(jìn)行增殖，并長出少量不定根。

組織培養(yǎng)獲得鐵皮石斛再生植株的途徑有多種，關(guān)于利用成熟種子進(jìn)行快繁，文獻(xiàn)報道較多的是用成熟的種子消毒后進(jìn)行無菌播種形成原球莖，并經(jīng)過增殖、分化發(fā)育成完整植株［1］。本研究中種子消毒后無菌播種誘導(dǎo)產(chǎn)生原球莖，并直接分化出幼苗，再通過轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基促進(jìn)小苗增殖，再進(jìn)行生根壯苗進(jìn)而達(dá)到快繁的目的。其他報道中的原球莖誘導(dǎo)、增殖再分化的過程需要3種不同的培養(yǎng)基，而本研究中，原球莖誘導(dǎo)、分化再增殖都在同一種培養(yǎng)基上，僅需再轉(zhuǎn)接進(jìn)行增殖，從而減少轉(zhuǎn)接過程，在工廠化育種中大大減少了工作量，降低了成本。

［1］ 楊柳平，劉暢慶，趙仁發(fā)，等.鐵皮石斛種子誘導(dǎo)原球莖組培快繁體系的研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012(7):54-57.