實時熒光定量PCR在結核病中的診斷價值*

曹燕珍　胡佳捷　王翠翠　趙　峰

新疆醫科大學附屬腫瘤醫院病理科，新疆烏魯木齊市　830011

論著

實時熒光定量PCR在結核病中的診斷價值*

曹燕珍胡佳捷王翠翠趙峰

新疆醫科大學附屬腫瘤醫院病理科，新疆烏魯木齊市830011

摘要目的：探討實時熒光定量PCR(FQ-PCR)在結核病診斷中的價值。方法：收集我院2013-2014年289例疑似結核組織，對組織進行常規組織病理學檢查、抗酸特殊染色，并利用FQ-PCR技術對組織中特異性結核分枝桿菌復合物IS986 基因區域進行擴增檢測。結果：抗酸特殊染色結果顯示，289例疑似結核組織中抗酸染色陽性94例，檢出率為32.5%；FQ-PCR檢測顯示，陽性182例，檢出率63.0%。經比對分析，抗酸染色與FQ-PCR的符合率為81.32%。結論：FQ-PCR對石蠟包埋組織中結核分枝桿菌檢測率高于抗酸特殊染色。同時應用兩種方法可以提高結核病的檢出率，可為結核分枝桿菌感染的病理診斷提供更準確的依據。

關鍵詞結核分枝桿菌實時熒光定量PCR組織

The Diagnosis Value of Real-time Fluorescent Quantitative PCR for Tuberculosis

CAO Yanzhen,HU Jiajie,WANG Cuicui,etal.DepartmentofPathology,TumorHospitalAffiliatedXinjiangMedicalUniversity,UrumchiCity，Xinjiang830011

ABSTRACT Objective:To investigate the value of real-time fluorescent quantitative PCR (FQ-PCR) in diagnosis of tuberculosis.Methods:A total of 289 suspected tuberculosis tissues were collected from 2013 to 2014 in tumor hospitalaffiliated Xinjiang medical university.All tissues were detected with histopathological examination and special staining acid.FQ-PCR was performed to amplify IS986 gene in tissue,which was specificity in mycobacterium tuberculosis complex.Results:The results of acid special dyeing showed that the positive rate was 32.5% (94/289).FQ-PCR results showed that the positive rate was 63.0% (182/289).The coincidence rate of acid fast stain and FQ-PCR was 81.32%.Conclusion:The detection rate of FQ-PCR are higher than acid dyeing for mycobacterium tuberculosis. Combined two methods can improve the detection rate of tuberculosis, and provide more accurate basis for the pathological diagnosis of mycobacterium tuberculosis infection.

KEY WORDS Mycobacterium tuberculosis,Real-time fluorescent quantitative PCR,Tissue

結核病是由病原菌結核分枝桿菌(M.tuberculosis)感染引起的可侵入人體全身各種器官，但主要侵犯肺臟的慢性傳染病[1]。結核病診斷的金標準是痰涂片或者培養找到結核分枝桿菌，但在臨床應用中，抗酸染色組織病理學也是非常重要的檢查手段，但抗酸特殊染色陽性率非常低[2]，使結核病的確診具有一定的難度。

實時熒光定量PCR (FQ-PCR)技術已廣泛用于各種病原體的核酸檢測，鑒于其具有的較高的靈敏度和特異性，常應用于血液、痰、胸腹腔積液和腦脊液等標本結核分枝桿菌DNA(TB-DNA)的檢測[1, 2]。結核分枝桿菌的TB-DNA檢測病理改變不典型的病例未見報道。本文在組織樣本的病理學HE染色和抗酸特殊染色診斷的基礎上，采用FQ-PCR法對新疆地區的疑似結核桿菌感染的石蠟包埋組織進行TB-DNA檢測，從而進行比較研究，為結核病的診斷治療的新方法提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料采用連續取樣的方法選取我院2013-2014年以壞死性上皮樣肉芽腫性病變為主要組織學改變，并被病理科醫師懷疑為結核的石蠟包埋組織病例289例，其中維吾爾族96例，回族11例，哈族7例，其他民族175例。FQ-PCR反應的對照設置：陰性質控品：空白蠟塊，同時提取DNA并做FQ-PCR；空白參照品：加入超純水替代DNA；臨界陽性質控品、陽性質控品：試劑盒提供的商品化產品，其實質為質粒DNA。

1.2儀器與試劑MX3000P real-time PCR儀(美國安捷倫公司)。石蠟組織DNA提取試劑為美同Omega公司產品；抗酸染色液為中國臺灣Baso公司產品；結核分枝桿菌核酸檢測試劑盒為中山大學達安基因股份有限公司生產的核酸擴增熒光試劑盒(國藥準字S20063011)。

1.3FQ-PCR檢測

1.3.1樣本DNA提取： 1ml二甲苯和無水乙醇混合離心1min，棄上清液，重復2次以去除石蠟和二甲苯；后加入220μl TL和20μl OB蛋白酶，56℃水浴4h以消化組織；90℃水浴1h，室溫離心1min，取上清液加入220μl BL，隨后分別加入無水乙醇，500μl HB，500μl Washing Buffer，室溫離心1min，棄濾液；將HiBind柱移置新的無菌1.5ml EP管中，加入已56℃預熱的Elution 100μl，室溫靜置10min，離心1min。用微量核酸蛋白分析儀測量樣本DNA的濃度和純度，OD 260/280值介于1.8~2.2之間的為合格樣本，提取的DNA原液保存于-20℃冰箱中，以作備用。

1.3.2PCR程序：93℃ 2min預變性；93℃ 45s變性結束后；55℃ 60s，先做10個循環；93℃ 30s，55℃ 45s(收集熒光信號)、再做30個循環；37℃ 1s延伸。

1.3.3判定標準：CT值<39.0時，結果判讀為陽性；CT值=40或無CT值時，結果判斷為陰性；陰性質控品CT值應為0.0或無數值；陽性質控品CT值≤37.0時，報告為陽性；臨界陽性質控品CT值>37.0的樣品，應重復檢測，復查結果CT值<40均可報告陽性，否則為陰性。陰性質控品CT值>臨界陽性質控品CT值>陽性質控品CT值，則本次實驗有效；否則，實驗無效。

1.4抗酸特殊染色檢測樣本組織切片厚3μm，使用TO生物透明劑進行脫蠟，10min重復1次，余步驟按照試劑盒說明書進行；檢測結果解釋：結核分枝桿菌呈亮紅色，呈桿狀或螺旋狀、單個或成簇排列。其他細菌及細胞呈藍色。

1.5統計學處理采用SPSS17.0進行數據處理和統計分析，分析不同檢測方法陽性率對比檢驗；采用卡方檢驗進行數據間的統計分析，當P<0.05為存在差異且有統計學意義。

2結果

2.1FQ-PCR與抗酸特殊染色檢測結果分析在289例疑似結核組織中，抗酸特殊染色法陽性94例； FQ-PCR法如圖1，陽性病例182例，見表1，其差異具有統計學意義(P<0.05)。其中抗酸染色檢查與FQ-PCR檢查吻合率為81.32%，不符合率為18.68%。

圖1　FQ-PCR檢測結果

注：A：FQ-PCR法檢測TB-DNA陰性；B：FQ-PCR法檢測TB-DNA陽性。

2.2染色陽性特殊病例分析分枝桿菌屬包括3大類：結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌和非結核分枝桿菌[2]。289例疑似結核病例中有4例特殊病例，其共同特點是FQ-PCR結果顯示沒有有效擴增，但是抗酸特殊染色后發現大量分枝桿菌。鑒于IS986 基因區域的特異性，其中1例在排除結核分枝桿菌感染和麻風分枝桿菌感染后，考慮為非結核分枝桿菌感染；另外3例診斷為麻風分枝桿菌感染。

表1　抗酸染色法與FQ-PCR法檢測結核

2.3疑似結核特征分析本研究涉及的疑似結核組織在性別和民族上差異較小，發生部位出現的差異見表2：淋巴結(121例，41.8%)，肺組織(102例，35.3%)，腹膜、胸膜、甲狀腺、乳腺、附件、盆腔、四肢、消化道等(66例，22.8%)。可見淋巴結感染率較全身其他部位較高。

表2　FQ-PCR法檢測不同部位結核分枝

3討論

Ziehl-Neeslen抗酸特殊染色法雖然應用廣泛，但對結核病的診斷存在局限性。首先，非特異性，有100余種分枝桿菌也是可以呈抗酸染色陽性；其次，抗酸桿菌的形態、大小的變化較大，導致結果判斷存在差異；再者，菌體分布不均，客觀漏診[3]。FQ-PCR可以巧妙的將核酸擴增(PCR)、雜交及光譜技術相結合，通過加入熒光標記探針，從而實現對檢測樣本中結核分枝桿菌的檢測。隨著該技術的廣泛應用，不規范的實驗操作和實驗室布局會導致假陽性檢測結果的出現。所以筆者在289例疑似結核病例的基因擴增實驗中，在實驗操作細節上，特別注意了以下幾點：密閉性、加樣完全、一次性耗材的使用、專區專用、避免污染。

本實驗中289例抗酸特殊染色陽性率為32.5%(94/289)，FQ-PCR檢測陽性率為 63.0%(182/289)，對比分析：抗酸特殊染色的陽性率及敏感性相對偏低，同時對相同樣本的疑似結核組織進行FQ-PCR檢測，陽性率和敏感性均高于抗酸特殊染色。目前，FQ-PCR標準化檢測方法已成為國家藥品監督管理局(CFDA)批準的只針對結核分枝桿菌DNA特異性體外擴增的檢測方法，其對麻風分枝桿菌和非結核分枝桿菌并不能進行有效擴增，且其具有簡便、靈敏、耗時短的優點[4]。而抗酸特殊染色法要求病理醫師必須逐張切片、逐個區域進行仔細查找菌體，且結果的判讀存在一定的人為因素，缺乏標準化和規范化[5]。但是脫離組織形態學的分

析，FQ-PCR檢測并不能準確反映組織中是否存在麻風分枝桿菌或非結核分枝桿菌等的感染情況，所以易造成漏診情況。

綜上所述，同時采用抗酸特殊染色和FQ-PCR檢測可以互補兩種檢測方法中存在的不足。二者結合，使結果判讀避免主觀差異，可提高結核病的檢出率，對結核病的病理診斷起到十分重要的作用。

參考文獻

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(編輯雅文)

收稿日期2015-07-03

*基金項目：新疆醫科大學附屬腫瘤醫院科研啟動基金(腫2013-01)

中圖分類號：R521

文獻標識碼：A

文章編號：1001-7585(2015)23-3178-03