藏紅花酸預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌的保護作用及機制探討

孫經武，王艷艷，房燦，樊維娜(濱州醫學院煙臺附屬醫院，山東煙臺 6400；咸陽市中心醫院)

藏紅花酸預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌的保護作用及機制探討

孫經武1，王艷艷1，房燦1，樊維娜2(1濱州醫學院煙臺附屬醫院，山東煙臺 264100；2咸陽市中心醫院)

摘要：目的觀察藏紅花酸預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌的保護作用，并探討其可能機制。方法 30只健康雄性Wistar大鼠隨機分為3組，C組大鼠先連續灌服0.5%羥甲基纖維素鈉(CMC-Na)1周，10 mL/(kg·d)，7 d后開胸，只穿線不結扎冠狀動脈；B組大鼠先連續灌服0.5%CMC-Na 1周，10 mL/(kg·d)，7 d后開胸結扎冠狀動脈前降支45 min，再灌注180 min，建立心肌缺血再灌注損傷模型；A組大鼠造模前1周連續給予0.5%藏紅花酸50 mg/(kg·d)灌胃，余處理同B組。采用HE染色法觀察大鼠心肌形態學改變，黃嘌呤氧化酶法檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)活性，硫代巴比妥酸法檢測血清丙二醛(MDA)含量，硝酸還原酶法檢測血清NO，比色法檢測血清內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)，RT-PCR法檢測心肌組織eNOS、iNOS mRNA。結果 C組大鼠心肌細胞排列整齊，無炎性細胞浸潤及及損傷、水腫等表現；與C組比較，B組大鼠心肌纖維排列紊亂，有斷裂，間質增寬、水腫，心肌纖維間可見大量炎性細胞浸潤；而A組改變程度較B組輕。與C組比較，A組血清MDA含量升高，B組血清SOD活性降低、MDA含量升高；與B組比較，A組SOD活性增加、MDA含量降低(P均<0.01)。與C組比較，A組血清eNOS水平降低，心肌組織iNOS、eNOS mRNA升高；B組血清NO、eNOS水平降低，心肌組織iNOS、eNOS mRNA升高(P<0.05或0.01)。與B組比較，A組血清NO、eNOS 及心肌組織eNOS mRNA升高，血清iNOS及心肌組織iNOS mRNA降低(P<0.05或0.01)。結論藏紅花酸預處理可減輕心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌形態學改變及心肌損傷，其機制可能與抑制iNOS表達、增加eNOS表達從而增加NO活性有關。

關鍵詞：藏紅花酸；心肌缺血再灌注損傷；內皮型一氧化氮合酶；誘導型一氧化氮合酶

急性心肌梗死在心血管疾病中屬于高發病率和高病死率的一員，以往臨床多采用溶栓或急診經皮冠狀動脈介入治療，雖然這些治療方法已被大大改善，但患者的治療效果并不理想，缺血再灌注損傷是影響患者康復的最重要因素之一[1]。藏紅花酸作為藏紅花提取物的主要活性成分，已經被證實可以減輕缺血損傷引起的氧化應激[2]、炎癥反應[3]及細胞凋亡[4]。本研究觀察了藏紅花酸預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌的保護作用，并探討其可能機制。

1材料與方法

1.1藥品及試劑藏紅花酸提取物購自濟南浩化實業有限責任公司，為磚紅色粉末，使用前以0.5%羧甲基纖維素鈉(0.5%CMC-Na)制成0.5%的懸浮液，劑量50 mg/kg。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、NO及內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，HE所需相關試劑如伊紅、蘇木精、鹽酸酒精分化液等由本實驗室自行配制而成。羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購于Sigma公司；TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、熒光定量檢測試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；引物設計與合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2實驗動物分組及預處理30只健康成年Wistar大鼠，均為雄性，體質量(220±20)g，購自山東大學實驗動物中心。所有大鼠隨機分為A、B、C組各10只。C組大鼠先灌服0.5%CMC-Na 1周，10 mL/(kg·d)，7 d后開胸，只穿線不結扎冠狀動脈；B組大鼠先灌服0.5%CMC-Na 1周，10 mL/(kg·d)，7 d后開胸結扎冠狀動脈前降支45 min，再灌注180 min，建立心肌缺血再灌注損傷模型；A組大鼠造模前1周給予0.5%藏紅花酸50 mg/(kg·d)灌胃，余處理同B組。

1.3大鼠心肌缺血再灌注模型制備 A、B組大鼠均制備模型。大鼠術前禁食6 h。20%烏拉坦按8 mL/kg對大鼠實施腹腔注射麻醉，仰臥位固定，打開電腦及Medlab信號采集系統，連接心電圖(右上肢紅色，左下肢黃色，右下肢黑色)記錄Ⅱ導聯心電圖。氣管插管連接小動物呼吸機(潮氣量8 mL/kg，頻率65次/min，吸呼比為1∶2)。在胸骨左緣剪開胸部皮膚，剪斷第4肋并分離肋間肌，刺破胸膜進入胸腔，暴露心臟，剪開心包膜，將心臟擠出胸腔，于左心耳與肺動脈圓錐交界處下約3～4 cm處穿線，結扎冠狀動脈左前降支，同時將一根直徑2 mm的聚乙烯管置于結扎線與冠狀動脈之間，拉緊結扎線使管壓迫冠狀動脈引起冠脈閉塞，造成急性心肌缺血模型，觀察心電圖，以出現ST段顯著抬高為結扎成功標志。在缺血45 min后，取出聚乙烯管及再灌注，以心臟表面顏色轉紅、抬高的ST段下降在1/2以上為再灌注成功標志，再灌注180 min。C組的動物手術過程與A、B組相同，但只穿線不結扎冠狀動脈。

1.4心肌組織形態學觀察采用蘇木精—伊紅染色方法對心肌組織進行染色，采用Image-proplus信號采集系統觀察心肌組織形態學改變。

1.5血清SOD活性、MDA含量檢測根據說明書方法操作，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力。

1.6血清NO、eNOS、iNOS水平檢測根據說明書方法操作，采用硝酸還原酶法測定NO，比色法測定eNOS、iNOS。

1.7心肌組織eNOS、iNOS mRNA檢測①引物設計與合成：eNOS、iNOS、β-actin的cDNA序列從Genebank中獲得。eNOS上游引物序列:5′-GGTGGACAACATCGCTCTG-3′，下游引物序列:5′-AGACAGCCAGGAGAAATCAAAC- 3′；iNOS上游引物序列:5′-TTGCTACAGGGTTTCATCCAG-3′，下游引物序

列:5′-ATGTTGTTGTCCAGTTCATCG-3′；β-actin上游引物序列:5′-GAAGTGTGACGTTGACATCCG-3′，下游引物序列:5′-TGCTGATCCACATCTGCTGGA-3′。②RNA提取與逆轉錄：用TRIzol一步法提取RNA，測定RNA的濃度和純度；逆轉錄按試劑盒說明書操作。③SYBRGreen實時定量PCR：按SYBR Premix Ex TaqTM的 RT-PCR試劑盒說明書操作，擴增條件為95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40個循環。用2-ΔΔCt方法分析各組mRNA的差異。

2結果

2.1各組大鼠心肌組織形態學變化C組大鼠心肌細胞排列整齊，無炎性細胞浸潤及及損傷、水腫等表現；與C組比較，B組心肌纖維排列紊亂，有斷裂，間質增寬、水腫，心肌纖維間可見大量炎性細胞浸潤；而A組心肌纖維排列紊亂，可見變性壞死灶，但程度較B組輕。

2.2各組大鼠血清SOD活性、MDA含量比較結果見表1。

表1　各組大鼠血清SOD活性、MDA含量比較

注：與C組比較，*P<0.01；與B組比較，△P<0.01。

2.3各組大鼠血清NO、eNOS、iNOS及心肌組織eNOS、iNOS mRNA水平比較結果見表2。

表2　各組大鼠血清NO、eNOS、iNOS及心肌組織eNOS、iNOS mRNA水平比較

注：與C組比較，*P<0.05，△P<0.01；與B組比較，#P<0.05，▲P<0.01。

3討論

近年來，缺血性心臟疾病已成為導致死亡的主要原因之一；通過纖維蛋白溶解或血管成形術的早期冠狀動脈再灌注已經成為此病的主要治療方法，并被廣泛應用到減輕缺血性損傷[5]。然而再灌注誘導激活一個名為再灌注損傷的有害級聯反應，其中氧化應激作為一個啟動脂質過氧化、DNA及蛋白質損傷的主要貢獻者發揮作用[6～8]。因此，開發減少氧化應激、提高再灌注治療心臟益處的輔助治療措施很有必要[9]。

藏紅花酸是藏紅花提取物的主要活性成分之一，在中國傳統醫學特別是藏醫學中發揮重要作用，其屬類胡蘿卜素物質，具有多不飽和共軛烯酸結構，既往的相關研究已經證實其對腦、肺、腎、肝的缺血再灌注損傷有保護作用,其機制可能涉及抑制氧化應激炎癥反應、細胞凋亡等方面。但尚未有藏紅花酸對心肌缺血再灌注損傷相關作用的研究，故本研究通過建立大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，進一步揭示藏紅花酸在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的保護作用機制。本研究顯示，與C組比較，B組心肌纖維排列紊亂，有斷裂，間質增寬、水腫，心肌纖維間可見大量炎細胞浸潤；而A組改變程度較B組輕。缺血再灌注后，氧自由基生成增多，其體現在血清SOD活性和MDA含量。SOD是細胞內源性的氧自由基清除劑，其可清除體內過多的氧自由基對心肌的損害，使心肌免于氧自由基的損傷。MDA是細胞膜脂質自由基和脂質過氧化物斷裂形成小分子物質，其活性增加可說明脂質過氧化反應增強，心肌組織受心肌缺血再灌注的損傷重。故SOD活性及MDA含量可反映心肌缺血再灌注損傷的輕重[10]。本研究還發現，與C組比較，A組血清MDA含量升高，B組血清SOD活性降低、MDA含量升高；與B組比較，A組血清SOD活性增加、MDA含量降低。間接說明藏紅花酸預處理可以減輕心肌缺血再灌注損傷。

生理情況下NO由eNOS催化合成，其可調節心臟的收縮與舒張功能，在體內亦可以實現從單個心肌細胞到完整心臟的耗氧量儲備，亦可調節內皮細胞的功能[11]。然而，在病理情況下，如糖尿病和心肌缺血再灌注時，炎癥反應會促使iNOS表達增加進而引起其合成的NO增加，對心臟功能產生不利影響[12]。此外，在IR或缺氧復氧的情況下，大量的NO與超氧化物自由基反應形成過氧亞硝酸鹽，它的氧代亞硝化反應可能會增加它的有害影響[13]。心肌缺血再灌注后內皮功能失調和炎癥過程的激活同時存在，內皮功能失調表現為eNOS活性降低，其產生的有益的NO減少，而炎癥過程激活后，進而引起iNOS激活，使其產生的NO增加，從而對心臟產生毒性作用。與C組比較，A組血清eNOS水平降低，心肌組織iNOS、eNOS mRNA升高；B組血清NO、eNOS水平降低，心肌組織iNOS、eNOS mRNA升高。與B組比較，A組血清NO、eNOS及心肌組織eNOS mRNA升高，血清iNOS及心肌組織iNOS mRNA降低。說明藏紅花酸預處理可以通過抑制iNOS表達、促進eNOS表達進而增加NO表達釋放來發揮心肌保護作用。

總之，藏紅花酸預處理可以減輕心肌缺血再灌注損傷后大鼠心肌組織的形態學損傷，減少氧自由基的生成，對心肌有保護作用，其機制可能與抑制iNOS表達、增加eNOS表達從而增加NO活性有關。

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(收稿日期:2014-11-20)

基金項目：煙臺市科技發展計劃項目(2012018)。

中圖分類號：R542.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)11-0029-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.11.010