白藜蘆醇對膿毒癥大鼠急性肺損傷的治療作用及機制

周繼紅，韋曉謀，陳宏，蘭慧慧，鄭妮，李金萬(柳州市工人醫院，廣西柳州 545005)

白藜蘆醇對膿毒癥大鼠急性肺損傷的治療作用及機制

周繼紅，韋曉謀，陳宏，蘭慧慧，鄭妮，李金萬(柳州市工人醫院，廣西柳州 545005)

摘要：目的觀察白藜蘆醇(Res)對膿毒癥大鼠急性肺損傷(ALI)的治療作用，并探討其可能的機制。方法60只Wistar大鼠，隨機分為假手術組(Sham組)、膿毒癥組(Sep組)、Res組各20只。Sep組和Res組采用盲腸結扎穿刺術制備膿毒癥相關性ALI大鼠模型，Sham組除不作環形結扎和針刺穿孔外，其余操作均與Sep、Res組相同。各組大鼠術畢均皮下注射生理鹽水30 mL/kg抗休克。造模1 h后，Res組大鼠股靜脈注射40 mg/kg的Res液2 mL，Sham、Sep組給予等量生理鹽水。各組在造模后2、6、12、24 h分別采用頸椎脫臼處死5只大鼠，取大鼠肺組織，HE染色觀察其病理形態，RT-PCR法檢測肺組織高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、Toll樣受體4(TLR4)mRNA，Western blotting法檢測HMGB1、TLR4蛋白。結果與Sep組相比，Res組造模后12 h肺組織病理變化有所減輕；造模后24 h各種病理改變明顯減輕，部分肺組織開始接近正常形態。與Sep組相比，Res組造模后2、6、12、24 h肺組織HGMB1、TLR4 mRNA及蛋白表達均下調(P均<0.05)。結論Res可以減輕大鼠膿毒癥誘導的肺損傷，其機制可能與下調肺組織HGMB1和TLR4 mRNA、蛋白表達有關。

關鍵詞：白藜蘆醇；膿毒癥；急性肺損傷；高遷移率族蛋白B1；Toll樣受體4

膿毒癥是在全身炎癥反應綜合征(SIRS)基礎上合并的感染，常導致全身重要臟器發生嚴重病理、生理改變，是現代危重病醫學面臨的難題，伴有膿毒癥休克及多器官功能障礙的患者病死率可高達80%～90%[1]。在膿毒癥并發的器官損傷中，肺是受損最嚴重的器官，主要表現為急性肺損傷(ALI)或急性呼吸窘迫綜合征。白藜蘆醇(Res)是虎杖的根莖提取物，屬于非黃酮類多酚化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等生物學活性，可下調各種炎癥介質的合成和分泌[2~4]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是膿毒癥致病的晚期關鍵性因子，Toll樣受體4(TLR4)作為HMGB1的重要受體參與HMGB1的信號轉導[5]。本研究觀察了Res對膿毒癥大鼠ALI的治療作用，并探討其機制。

1材料與方法

1.1實驗動物分組及處理 SPF級Wistar大鼠，雄性，13～15周齡，體質量200～250 g，共60只，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(桂2013-0008)。按隨機數字表法將大鼠分為假手術組(Sham組)、膿毒癥組(Sep組)和Res組，每組20只。Sep、Res組根據Rittirsch等[6]定義的盲腸結扎穿刺術(CLP)的標準化程序制備膿毒癥實驗模型，以戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，麻醉滿意后以碘伏常規消毒腹部區域，剃去腹部毛發，鋪無菌洞巾，沿腹正中線作一長約1 cm縱行切口，以無菌鑷探查并暴露盲腸，在距盲腸末端約1 cm處結扎盲腸，以27號針頭垂直盲腸腸管貫通穿刺3次并擠出少量腸內容物至腹腔內，將穿刺后的盲腸還納腹腔，逐層縫合，造模時間控制在10 min以內。Sham組除不作環形結扎和針刺穿孔外，其余操作均與Sep、Res組相同。各組大鼠術畢均給予皮下注射生理鹽水30 mL/kg抗休克。Sep組造模后1 h股靜脈注射生理鹽水2 mL；Res組股靜脈注射40 mg/kg的Res(購自廣東廣弘藥材有限公司，并由廣西醫科大學中藥鑒定室鑒定為正品)2 mL。本實驗中動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.2標本收集及處理各組大鼠在造模后2、6、12、24 h分別頸椎脫臼處死5只大鼠，取右下肺組織，部分肺組織置于-80 ℃冰箱保存，用于測定HMGB1、TLR4 mRNA；部分肺組織用4%中性甲醛溶液固定，用于病理觀察。

1.3各組大鼠肺組織病理形態觀察取大鼠肺組織，常規脫水，浸蠟，石蠟包埋，切片厚度3～4 μm，行HE染色，Olympus BX51顯微鏡觀察并采集圖像。

1.4各組大鼠肺組織HMGB1、TLR4 mRNA檢測 采用RT-PCR法。所有引物均由TaKaRa公司設計并合成，設計軟件為Primer premer。取肺組織50 mg，每個待檢標本設3個平行孔，按TRIzol法常規提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，使用ABI 7500熒光定量PCR儀進行擴增，結果由ABI 500 PCR儀自動生成，計算HMGB1、TLR4 mRNA的相對表達量。

1.5各組大鼠肺組織HMGB1、TLR4蛋白檢測采用Western blotting法。取大鼠肺組織50 mg，按照試劑盒說明提取總蛋白。取等質量的樣本蛋白(30 μg)，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(初始電壓80 V，后改為100 V,各1 h)；將標本蛋白轉移至PDVF膜上；TBST洗滌3次，每次5 min；加入TBST稀釋的一抗(兔抗HMGB1,1∶200稀釋；兔抗TLR4，1∶100稀釋)，4 ℃搖床過夜。TBST洗滌3次，每次10 min；加入熒光標記的二抗工作液(1∶3 000)，室溫下避光振蕩1 h。TBST洗滌3次，每次10 min。用KODAK成像系統曝光獲取圖像，利用該成像儀綁定的軟件分析灰度值，進行定量分析，以條帶灰度值的比值作為該組樣品蛋白水平的相對表達量。

2結果

2.1各組大鼠肺組織病理形態鏡下觀察可見，造模后2 h，各組大鼠肺組織均未見明顯異常。Sham組大鼠在6 h可見輕度灶性肺間質或肺泡水腫，肺血管內中性粒白細胞開始聚集；12 h達高峰；24 h炎癥幾乎完全消退，但各時間點變化均較Sep組大鼠輕。Sep組大鼠在6 h可見肺組織重度炎性反應，血管充血，間質水腫出血，肺泡壞死，肺泡腔范圍消失，淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞浸潤；12 h達到高峰。Res組大鼠在12 h可見與Sep組相似的病理變化，但與Sep組相比有所減輕；24 h后肺組織炎性反應病灶明顯減少，肺泡水腫、肺出血、肺實變和中性粒細胞浸潤明顯減輕。

2.2各組大鼠肺組織HMGB1及TLR4 mRNA、蛋白表達比較結果見表1。

表1　各組大鼠肺組織HMGB1及TLR4 mRNA、蛋白表達比較

注：與Sham組比較，*P<0.01；與Sep組比較，△P<0.05，#P<0.01。

3討論

由肺外因素所致的ALI常常預示患者第一個器官功能障礙的開始，其中非肺源性膿毒癥是最常見原因[7]。HMGB1具有“晚期”炎癥介質的作用，參與膿毒癥的后期病理生理發展過程[8]。當炎癥刺激細胞壞死或受損時，核內的HMGB1可釋放到胞外，誘導單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突細胞等合成分泌促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等；而促炎因子又反過來促進HMGB1的分泌，同時HMGB1和炎癥介質互為誘導，正反饋瀑布式擴大SIRS，并且在炎性反應的后期，這種正反饋效應對炎性反應的維持起到了相當重要的作用，引起多器官組織損傷，最終導致MODS。研究[9,10]發現，HMGB1出現較晚，大量釋放約在炎癥暴發后20 h，持續20～72 h后降低，與其他早期炎性因子不同的是，出現較晚的HMGB1能為臨床提供較長的窗口期來治療由它引發的重癥炎癥。TLR4作為HMGB1的重要受體參與HMGB1的信號轉導，重組HMGB1誘導相關細胞釋放致炎細胞因子，而使用TLR4中和抗體處理后致炎細胞因子釋放受到明顯抑制[11~13]。

Res對膿毒癥肺損傷具有治療作用，在脂多糖誘導的小鼠ALI模型中，Res能明顯抑制肺部炎癥因子的釋放，減輕肺損傷程度[14,15]。在鼠類CLP誘導的大鼠膿毒癥模型中，腹腔內給予Res能明顯減少肺部炎癥介質TNF-α及IL-6的產生，上調血紅素氧合酶1的表達，減輕肺部的病理性損傷[16]。Res的生物學活性為治療膿毒癥提供了新思路，多數報道[17~20]認為其抗炎作用與其下調NF-κB和抑制TNF-α、IL-1β等早期炎癥因子有關，但Res對晚期炎癥介質HMGB1及其重要受體TLR4表達的影響如何鮮有報道。本實驗中，相比于Sham組，Sep組肺組織病理損傷嚴重，細胞大量凋亡和壞死，大量的炎癥細胞浸潤，肺組織HMGB1及TLR4 mRNA、蛋白表達顯著升高，且隨時間的延長呈逐漸增加趨勢，至術后24 h達高峰后下降。Res組Res干預后在整體水平減輕了膿毒癥引起的ALI病理損傷，可以下調肺組織中HMGB1及TLR4 mRNA、蛋白表達。結果提示Res可以影響HMGB1及TLR4的表達，減輕炎癥損傷及改善預后。

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(收稿日期：2014-11-28)

中圖分類號：R563

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)11-0032-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.11.011