維藥刺山柑抑制金黃色葡萄球菌生物膜的研究

徐琦等

[摘要] 目的 研究維藥刺山柑提取及萃取物對金黃色葡萄球菌體外培養生物膜（BF）形成及清除作用的影響，為進一步開發維藥刺山柑的應用價值及臨床輔助治療耐藥性感染提供實驗依據。 方法 通過醇提法獲得維藥刺山柑醇提物，并通過石油醚、乙酸乙酯及正丁醇的萃取獲得不同極性的萃取物；使用96孔板培養金黃色葡萄球菌體外BF模型，采用試管二倍稀釋法測定維藥刺山柑不同提取物/萃取物的最低抑菌濃度（MIC），研究其對金黃色葡萄球菌BF形成的影響；同時通過檢測維藥刺山柑提取物對成熟BF中活菌數的影響，評價其對成熟BF的清除作用。 結果 維藥刺山柑醇提物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物以及正丁醇萃取物對金黃色葡萄球菌的MIC分別為52.50、50.00、45.00、46.25 mg/mL。當濃度分別為26.26、23.13、25.00、22.50 mg/mL時維藥刺山柑醇提物及不同萃取物可在早期階段干擾金黃色葡萄球菌BF的形成，致活菌數明顯少于空白對照組，差異有統計學意義（P < 0.05），其中4倍MIC濃度的正丁醇萃取物抗菌活性明顯，與青霉素組比較，差異無統計學意義（P > 0.05），其中高濃度醇提物及正丁醇萃取物24 h清除BF的作用較強，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）；維藥刺山柑醇提物及不同萃取物還可以抑制并有效清除金葡菌成熟BF，其高濃度抗菌活性與青霉素比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 維藥刺山柑醇提物及不同溶劑萃取物在體外具有抑制金黃色葡萄球菌BF形成的作用，并且能通過破壞已形成的BF起到殺滅細菌的作用，為臨床輔助治療耐藥性金葡菌感染，提供實驗依據。

[關鍵詞] 金黃色葡萄球菌；維藥刺山柑；生物膜

[中圖分類號] R258.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）01（b）-0020-05

[Abstract] Objective To study the effect of Capparis spinosa. extract on Staphylococcus aureus′biofilm （BF） in vitro， and provide the experimental basis of clinical application. Methods The Capparis spinosa. extract by alcohol extraction was obtained， and the different polarity extracts was obtained by extraction with petroleum ether， ethyl acetate and n-butanol； the Staphylococcus aureus BF in vitro was induced by 96-well plates， the determination of the tube double dilution method was used to measure the minimal inhibitory concentrations （MICs） in different extracts/extraction from Capparis spinosa.， the impact of BF formation for Staphylococcus aureus was evaluated. At the same time， the evaluation of its scavenging effect on mature BF was done by detecting the impact of Uyghur medicine Capparis spinosa. extract on the number of living bacterium in mature BF. Results The MIC for Staphylococcus aureus in Capparis spinosa. alcohol extract， petroleum ether extraction， ethyl acetate extracts were 52.50， 50.00， 45.00， 46.25 mg/mL， respectively. When the concentration reached 26.26， 23.13， 25.00， 22.50 mg/mL， alcohol extraction， ethyl acetate and n-butanol samples could inhibit the formation of BF， the number of living bacterium was significantly less than the blank control group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Among them， four times the concentration of MIC n-butyl alcohol extract antibacterial activity was significantly obvious， compared with Penicillin group， there was no statistically significant difference （P > 0.05）， the role of clearing BF of the high concentration of alcohol extract and n-butanol extract was stronger in 24 h， compared with the blank control group， there was significant difference （P < 0.05）； Uyghur medicine Capparis spinosa. alcohol extract and different extract could inhibit and effectively remove Staphylococcus aureus mature BF， compared with Penicillin， there was no statistically significant difference in its high antibacterial activity （P > 0.05）. Conclusion Capparis spinosa. alcohol extract ethyl， ethyl acetate and n-butanol samples can effevtively inhibit the BF′s formation of Staphylococcus aureus in vitro. It can also destroy the mature BF.

[Key words] Staphylococcus aureus； Uyghur medicine Capparis spinosa.； Biofilm

刺山柑（Capparis spinosa.）又名槌果藤，為白花菜科山柑屬植物。維語稱“波里克果”或“卡盤”等。該植物在我國新疆分布較廣，以吐魯番地區最多，此外，西藏、甘肅等局部地區也有少量分布[1-2]。據《新疆藥用植物志》記載，刺山柑屬食藥兩用植物，其葉子、花蕾、果實和根皮均能入藥。維吾爾族民間常用其鮮果搗碎后外敷治療疾病，其對痛風治療總有效率達90%以上，是一種傳統的維吾爾藥。現代研究表明，維藥刺山柑的化學成分包括生物堿類、黃酮類、揮發油類、脂肪類、聚戊烯醇類及吲哚類和脂肪族類芥子油苷等[3]。其具有抗菌消炎、抗病毒[4]、抗腫瘤[5]及保肝[6]等活性。但刺山柑對于細菌生物膜（BF）的影響卻未見相關報道。BF 是細菌為抵抗不利環境，所形成的一種獨特的物質，由細菌及其分泌的多聚物組成[7]。它能夠使細菌以非常精細的方式相互粘連，同時也能發揮屏障和占位性保護作用。細菌生物膜內細菌由于生物膜的保護，不容易被機體及抗生素清除，發生耐藥性感染，常可導致疾病遷延不愈或急性發作，給臨床治療帶來巨大困難。金黃色葡萄球菌是一種臨床常見的重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），可引起許多嚴重感染，也是在特定環境中極易形成生物膜的細菌。該菌是目前造成嚴重醫院內感染的主要原因。本研究通過微孔法構建金黃色葡萄球菌生物膜體外模型，探討維藥刺山柑醇提取及不同極性萃取物對BF形成及清除的影響，為維藥刺山柑臨床應用提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

生物安全柜Thermo公司（1300 SERIES A2），Olypus光學顯微鏡，iMark酶標儀（Bio-Rad公司），37℃恒溫培養箱（DNP-9162型），HH-S4恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠），PL6001-S電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司），N001旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司），SHB-3循環多用式水泵，SB-1000水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司），KQ-700DV型超聲清洗器（昆山市超聲儀器廠）。

1.2 試藥

維藥刺山柑系新疆吐魯番藥材干品，經新疆醫科大學天然藥物化學王曉梅副教授鑒定為白菜花科山柑屬植物刺山柑的果實。

金黃色葡萄球菌（ATCC25923）為中國生物藥品鑒定所提供。將購置的標準菌株接種于營養瓊脂平板上，37℃、24 h進行復蘇，傳代備用。取培養6 h金黃色葡萄球菌菌液，經麥氏比濁濃度為1×106/mL，并用營養肉湯1000倍稀釋，作為工作濃度。通過傾注平板法計數，得出金黃色葡萄球菌實驗濃度為4×105/mL。

1.3 維藥刺山柑樣品的制備[8]

1.3.1 乙醇提取物的制備 維藥刺山柑藥材干品粉碎后取200 g藥材干粉，加入95%乙醇1200 mL進行提取，分3次回流提取，每次2 h。合并提取液，過濾，于旋轉蒸發儀上濃縮至少量濃縮液，將濃縮液倒入干燥平皿中，自然晾干，稱重備用。石油醚萃取物：將所得的浸膏加蒸餾水浸泡溶解，然后倒入萃取裝置中，加蒸餾水后加入180 mL石油醚，靜置分層收集石油醚萃取液，反復3次，合并萃取液，隨后用旋轉蒸發儀濃縮，干燥后稱重備用。

1.3.2 乙酸乙酯萃取物的制備 將石油醚萃取后所得的水相，加入乙酸乙酯萃取，反復3次，合并萃取液用旋轉蒸發儀濃縮，干燥后稱重備用。

1.3.3 正丁醇萃取物的制備 將乙酸乙酯萃取后所得的水相，加入正丁醇萃取，方法同上，萃取物干燥后稱重備用。

2 方法與結果

2.1 最低抑菌濃度（MIC）測定

采用試管二倍稀釋法測定維藥刺山柑醇提物及不同萃取物對金黃色葡萄球菌MIC。敏感性分類和質量控制均采用美國臨床檢驗標準委員會[NCCLS（2004）]推薦標準[9]。結果顯示，維藥刺山柑醇提物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物對金黃色葡萄球菌的MIC測定結果分別為52.50、50.00、45.00、46.25 mg/mL，青霉素MIC為8×10-5 mg/mL。

2.2金黃色葡萄球菌生物膜微孔板模型的構建

實驗步驟參照文獻[10]稍作改進，將96孔平底微孔板四周加肉湯培養基作為空白對照，稀釋為實驗濃度的金黃色葡萄球菌菌液200 μL加入剩余微孔中，將微孔板置于37℃恒溫培養箱中培養，24 h后金黃色葡萄球菌生物膜即可在微孔板底部形成，使用前用PBS反復沖洗。

2.3 統計學方法

所有實驗數據均用應用SPSS 12.0統計學軟件進行處理，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，行t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2.4 維藥刺山柑抑制金黃色葡萄球菌BF形成的作用

將實驗濃度的金黃色葡萄球菌接種于96孔板，即從開始建立BF模型時就分別加入不同濃度的維藥刺山柑醇提物，石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物，其初始濃度分別為420、400、360、370 mg/mL，以二倍稀釋法稀釋制備系列濃度的培養液加入微孔板，并設置不含藥物的空白對照，24 h后測定光密度值（波長450 nm，波長570 nm），計算出細菌的抑制率，其公式為：抑制率（%）=（1-實驗組/對照組）×100%[（溶劑空白值-樣品值）/（溶劑空白值-陰性對照值）×100%][11]，并做活菌計數。結果顯示，維藥刺山柑對金黃色葡萄球菌生物膜形成有抑制作用。在構建金黃色葡萄球菌BF模型時，就分別加入維藥刺山柑醇提物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物系列濃度培養液，并設置不含藥物的空白對照。培養24 h后，微孔板底部表面黏附的活菌計數見表1，結果顯示，維藥刺山柑醇提物及不同極性的萃取物各濃度都具有顯著的抗菌活性且呈劑量依賴性，各組與空白對照組比較，黏附活菌數明顯減少，差異有統計學意義（P < 0.05），其中石油醚萃取物的抗菌活性與醇提物及正丁醇萃取物相比較弱（P < 0.05），與乙酸乙酯萃取物相比，載體表面活菌數多但差異無統計學意義（P > 0.05）。維藥刺山柑醇提物/萃取物的高濃度組（4×MIC組）抗菌活性明顯，其中正丁醇萃取物高濃度處理組與青霉素處理組黏附活菌數差異無統計學意義（P > 0.05）。以上結果說明維藥刺山柑醇提物及不同極性萃取成分都能在體外明顯抑制金黃色葡萄球菌BF的形成，且高濃度正丁醇萃取物作用效果與青霉素效果相仿。

2.5 維藥刺山柑對金黃色葡萄球菌BF的清除作用

構建金黃色葡萄球菌生物膜微孔板模型，24 h待金黃色葡萄球菌生物膜形成后，用PBS緩沖液沖洗。隨后分別加入含維藥刺山柑醇提物及萃取物系列濃度的培養液，并設置不含藥物的空白對照及陰性對照，37℃培養。分別于8、18、24 h孵育1 h后棄去上清，PBS緩緩清洗3次，使用連續稀釋法進行活菌計數，測定重復3次，計算平均值。藥物作用后的金黃色葡萄球菌BF，經PBS反復清洗后，加入結晶紫染色30 min，隨后將結晶紫傾出，清洗，加入95%的乙醇溶解生物膜，測定600 nm處的OD值，記錄數據。不同濃度維藥刺山柑醇提物/萃取物對成熟金黃色葡萄球菌BF的清除作用。構建金黃色葡萄球菌BF模型，24 h后不同濃度的維藥刺山柑醇提物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物及正丁醇萃取物作用于已經形成的BF。結果顯示，當維藥刺山柑醇提物/萃取物濃度為0.5×MIC時，相應組的生物膜細菌計數在8、18、24 h時與對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。當各組濃度達到1×MIC時，對金黃色葡萄球菌生物膜內細菌顯示出抗菌活性，18 h內細菌計數與空白組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。當各組濃度增加至4×MIC時，培養8、18、24 h后金黃色葡萄球菌BF內活菌數明顯減少，與空白組比較，差異有統計學意義（P < 0.05），其中正丁醇萃取物處理組與石油醚及乙酸乙酯萃取物處理組BF內活菌數比較，差異有統計學意義（P < 0.05），見表2，但24 h內BF中的細菌不能完全被清除。各時間段之間活菌數無顯著性差異。以上結果說明維藥刺山柑醇提物及不同極性萃取成分都能在體外有效清除金黃色葡萄球菌BF，且正丁醇萃取物作用效果最好。

3 討論

近年來研究證實臨床上部分遷延難愈的感染多源于細菌生物膜的形成，而金黃色葡萄球菌是導致慢性感染的主要致病菌之一[12]。金黃色葡萄球菌生物膜是細菌在不利的生長環境中形成的優勢型，細菌菌體被其自身分泌的多種糖蛋白包裹，形成膜狀物，阻礙藥物的通透，從而導致不容易被機體及抗生素清除，發生耐藥性感染。在特定環境中金黃色葡萄球菌是極易形成BF的細菌，一旦形成BF，常規劑量的抗生素作用無效，須加大藥物劑量和延長用藥時間，但伴隨而來的是耐藥菌株的產生[13]。抗菌藥物的耐藥問題被世界衛生組織認為是我們面臨的重要健康問題。因此，尋找能夠抑制細菌BF生長或清除BF的藥物已成為研究熱點。

多項研究表明，中藥在防治細菌生物膜引起的感染方面有著特殊的優勢，中藥不僅可以抑制細菌生物膜的形成，清除已經形成的生物膜，其與抗生素聯合應用還能增強抗生素的抗感染能力。同時，中藥具有藥材來源廣，毒副作用小，藥理作用強，在菌體內作用途徑多樣化，不易導致細菌耐藥等優點，已成為繼抗生素之后抗感染藥物研究的熱點[14]。刺山柑是一種天然食藥兩用草本中草藥，原產于地中海沿岸，喜生于干旱有砂石的低山坡，沙地上，可以防風固沙，保護生態環境，具有很好的生態價值。該植物在我國新疆分布較廣，以吐魯番地區最多，此外，西藏、甘肅等局部地區也有少量分布。由于刺山柑具有多種藥理活性，在新疆地區是一種常用的維吾爾藥材，據《新疆藥用植物志》記載，該植物的果實、枝葉和根皮均能入藥，主要功能有消炎止痛、祛風、散寒及除濕。近年來有研究表明，刺山柑所含化學成分主要包括：生物堿類、黃酮類、揮發油類、脂肪類、聚戊烯醇類及吲哚類和脂肪族類芥子油苷等[15-16]。刺山柑藥理活性具有多樣性， 其花芽中的甲醇提取物具有較強的抗氧化活性[17]；果實具有降血脂、降血糖[18]，抑制真菌的作用；醇提物具有良好的抗菌消炎，抗腫瘤等活性等。但刺山柑對于細菌生物膜的影響卻未見相關報道。本文就維藥刺山柑乙醇提取物以及不同極性萃取物對金黃色葡萄球菌BF形成及清除作用的影響進行了初步探討。結果顯示，刺山柑提取物在體外能有效抑制金黃色葡萄球菌BF的形成，與臨床用藥青霉素相比效果差異無統計學意義。但由于維藥刺山柑醇提物及萃取物由多種成分組成，其抑制BF形成及清除BF的作用很可能是多成分多途徑的綜合結果。其中的主要有效成分以及其抑菌的具體機制還有待今后進一步深入研究。

我國新疆地區維藥刺山柑資源豐富，但目前沒有得到充分利用，本文選用維藥刺山柑果實研究其抗菌活性，對進一步研究其藥理作用，提高其利用價值具有重要意義。相信隨著科學技術的不斷發展，對維藥刺山柑的化學組成、藥理效應及臨床應用等方面的深入研究，會為維藥刺山柑的應用開辟廣闊的前景。

[參考文獻]

[1] 馬生軍，張濤，樊國全，等.維藥材刺山柑種子形態特征與發芽條件研究[J].種子，2012，13（7）：62-64.

[2] 陳小鈞.新疆特色植物——刺山柑[J].新疆林，2013，（6）：26.

[3] 楊濤，程雪梅，于富生，等.刺山柑果實的化學成分研究[J].西北藥學雜志，2010，25（4）：260-263.

[4] Arena A，Bisignano G，Pavone B. Antiviral and immunomodulatory effect of a lyophilized extract of Capparis spinosa. Buds [J]. Phytother Res，2008，22（3）：313-317.

[5] Kulisic-Bilusic T，Schmoller I，Schnabele K. The anticarcinogenic potential of essential oil and aqueous infusion from caper （Capparis spinosa.） [J]. Food Chem，2012，132（1）：261-267.

[6] Yusufoglu H，Soliman GA，Abdel-Rahman RF，et al. The potential hepatoprotective activity of Allium paniculatum and Capparis spinosa on thioacetamide induced hepatotoxicity in rats [J]. Planta Med，2014，80（10）：800.

[7] Waldrop R，McLaren A，Calara F，et al. Biofilm growth has a threshold response to glucose in vitro [J]. Clinical Ortho-paedics and Related Research，2014，472（11）：3305-3310.

[8] 郭艷，蔣雯雯，馬淼.刺山柑果實抗炎活性部位與致敏部位的分離[J].時珍國醫國藥，2012，23（6）：1348-1350.

[9] National Committee Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptiblity testing [S]. NCCLS，2004：1-159.

[10] 彭曉云，黃曉敏，鄭秋樺，等.不同培養條件對金黃色葡萄球菌生物膜生長影響實驗研究[J].陜西醫學雜志，2009， 38（7）：780-782.

[11] 朱明，徐琦，吳曄華，等.新疆黑蜂膠體外抑制大腸桿菌生物膜的研究[J].中國醫藥導報，2013，10（36）：12-14.

[12] Pihl M，Arvidsson A，Skep M，et al. Biofilm formation by Staphylococcus epidermidis on peritoneal dialysis catheters and the effects of extracellular products from Pseudomonas aeruginosa [J]. Pathog Dis，2013，67（3）：192-198.

[13] Beeton ML，Ldrich W，Janice R，et al. The antimicrobial and antibiofilm activities of copper（Ⅱ） complexes [J]. J Inorg Biochem，2014，140：167-172.

[14] Bjarnsholt T，Ciofu O，Molin S，et al. Applying insights from biofilm biology to drug development -can a new approach be developed [J]. Nat Rev Drug Discov， 2013，12（10）：791-808.

[15] 王響華，陳文，郭小娜，等.維藥刺山柑果實中香草酸和原兒茶酸的含量測定[J].中國實驗方劑學雜志，2012， 18（23）：71-73.

[16] 周靜，美麗萬·阿不都熱依木.HPLC法測定維藥刺山柑種子中沒食子酸和蘆丁的含量[J].西北藥學雜志，2014， 29（2）：117-119.

[17] 吳翠云，周忠波，鄧小勤，等.刺山柑提取物對DPPH自由基的清除作用[J]. 西北農業學報，2009，18（1）：230-233.

[18] Huseini HF，Hasani R，Nayebi N，et al. （Caper） fruit extract in treatment of type 2 diabetic patients： A randomized double-blind placebo-controlled clinical trial [J]. Complement Ther Med，2013，21（5）：447-452.

（收稿日期：2014-10-09 本文編輯：衛 軻）