過表達IrrE基因提高油菜的抗鹽脅迫能力

周文波等

摘要：以過表達IrrE基因油菜T3代植株和非轉(zhuǎn)基因油菜植株為試驗材料，研究不同濃度NaCl脅迫下過表達IrrE對油菜植株抗鹽脅迫能力的影響，檢測不同濃度NaCl脅迫下非轉(zhuǎn)基因和過表達IrrE基因油菜植株葉片中的抗氧化酶活性如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）的活性以及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、脯氨酸、可溶性糖含量和相對電導(dǎo)率（REC）。結(jié)果顯示，隨著NaCl濃度的增加，非轉(zhuǎn)基因和過表達IrrE基因油菜植株各自的抗氧化酶活性均呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢，而MDA含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量和相對電導(dǎo)率都隨著NaCl濃度的增加而逐漸增加；但與非轉(zhuǎn)基因相比，在高濃度NaCl脅迫下過表達IrrE基因油菜植株具有較高的抗氧化酶活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量以及較低的MDA含量和相對電導(dǎo)率，表明在高鹽脅迫下過表達IrrE能夠顯著地提高轉(zhuǎn)基因油菜植株的抗鹽脅迫能力。

關(guān)鍵詞：IrrE基因；油菜；鹽脅迫；氧化酶

中圖分類號： Q945.78文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0104-04

收稿日期：2014-08-31

基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（編號：2013CB733903）；國家“863”計劃（編號：2012AA063503）；國家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ棧ň幪枺?014ZX0801201B）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（編號：201103007）；西南科技大學(xué)博士研究基金（編號：11zx7104）；四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心開放基金（編號：13zxsk04）。

作者簡介：周文波（1987—），男，四川自貢人，碩士研究生，從事植物遺傳轉(zhuǎn)化與抗逆分析研究。E-mail：zhouwenboxkd@sina.com。

通信作者：王勁，教授，從事植物遺傳方向的研究。E-mail：wjdsz@vip.sina.com。近年來，由于人們在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中的不科學(xué)灌溉、濫用化肥、濫伐森林導(dǎo)致的植被破壞以及工業(yè)活動產(chǎn)生的溫室氣體等因素，使土壤鹽堿化問題日益嚴重，土壤鹽堿化已成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的重要因子之一[1-2]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，全球鹽堿土總面積約為10億hm2，約占陸地面積的10%；世界上許多國家和地區(qū)的土壤均存在鹽堿化的風(fēng)險，中國受鹽堿化影響的土地面積占可利用土地總面積的4.88%[3]。因此，對鹽堿地的改造治理、合理開發(fā)、高效利用勢在必行。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展，利用分子育種技術(shù)尤其是轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗鹽脅迫作物新品種已成為當(dāng)前抗逆研究的熱門領(lǐng)域，也成為高效利用開發(fā)鹽堿土的重要手段之一。因此，了解植物抗鹽脅迫的分子調(diào)控機理與抗鹽脅迫基因的充分挖掘和研究對培育抗鹽脅迫作物新品種具有重要意義。

土壤含鹽量過高嚴重影響植物的生長和發(fā)育，過量鹽離子主要通過引發(fā)滲透脅迫、離子毒害和氧化脅迫對植物造成傷害，植物則通過調(diào)節(jié)氣孔開度、合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、區(qū)隔過量離子以及清除活性氧物質(zhì)等方式來減輕脅迫損傷[4]。IrrE基因定位于耐輻射異常球菌（Deinococcus radiodurans）的基因組1號染色體上，編號DR_0167，全長987 bp，其在耐輻射異常球菌對電離輻射引起的DNA損傷修復(fù)過程中具有重要作用。IrrE基因作為一種輻射應(yīng)答的調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)節(jié)異常球菌 R1中recA和pprA基因的表達，他們分別編碼重組酶A和輻射誘導(dǎo)蛋白[5]。Gao等研究發(fā)現(xiàn)，將IrrE基因在大腸桿菌中異源表達能夠提高菌株的輻射抗性以及氧自由基的清除能力[6]。Pan等對轉(zhuǎn)IrrE基因菌株及對照菌株進行了一系列脅迫試驗，結(jié)果顯示IrrE提高了大腸桿菌的抗鹽脅迫、抗氧化脅迫以及抗高溫脅迫的能力；為研究IrrE在植物中的抗逆效果，Pan等又將IrrE基因轉(zhuǎn)入油菜中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因油菜植株能夠在350 mmo/L NaCl處理下6周后正常開花結(jié)子，而對照非轉(zhuǎn)基因油菜植株在相同條件下處理2周后死亡[7]。

但目前對IrrE基因在植物中是如何提高植株抵抗逆境脅迫能力的分子機理還知之甚少，相關(guān)研究報道也很少。先前的研究以轉(zhuǎn)IrrE基因油菜T0代植株為試驗材料，其后代植株抵抗鹽脅迫的能力如何還不清楚。因此，本研究以轉(zhuǎn)IrrE基因油菜T3代植株為試驗材料，以非轉(zhuǎn)基因油菜植株為對照，探討不同鹽濃度脅迫下IrrE基因過表達對油菜植株相關(guān)生理生化的影響，為充分了解過表達IrrE基因在植物抵抗鹽脅迫過程中的作用和在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中應(yīng)用IrrE基因培育抗鹽作物新品種提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料培養(yǎng)與鹽脅迫處理

非轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜（Brassica napus）種子84100-18（玻里馬細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系）由四川大學(xué)遺傳學(xué)實驗室提供，過表達IrrE轉(zhuǎn)基因T3代油菜種子由西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院極端環(huán)境生物資源與利用實驗室以84100-18為受體材料遺傳轉(zhuǎn)化而得。將非轉(zhuǎn)基因油菜種子和轉(zhuǎn)基因油菜種子滅菌后分別接種在MS和含50 mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，催芽生根后分別播于塑料盆中，每盆2株幼苗，以蛭石 ∶營養(yǎng)土=1 ∶3為基質(zhì)，MS營養(yǎng)液培養(yǎng)，置于溫室[光周期，16 h光照、8 h黑暗；光照強度500 μmol/（m2·s）；溫度（25±4） ℃；相對濕度80%]下培養(yǎng)。

待油菜幼苗長出5～6張真葉時進行鹽脅迫處理，每個處理3盆（重復(fù)3次）。不同濃度NaCl處理分為7組：在1/2MS營養(yǎng)液中分別加入0、100、150、200、250、300、350 mmol/L NaCl，溶液澆灌量約為200 mL，浸透培養(yǎng)基質(zhì)，盆底墊塑料托盤，以便及時將流出的鹽溶液倒回盆內(nèi)，防止鹽分流失。處理24 h后，采樣（選取植株由上到下第3張葉片，去除葉脈后，剪碎混勻），用于PCR和相應(yīng)生理生化指標(biāo)檢測。

1.2T3代轉(zhuǎn)基因油菜植株的PCR檢測

用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因油菜葉片的總DNA，以此為模板，以PBI121-IrrE載體的質(zhì)粒為陽性對照，以非轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照進行PCR檢測。PCR檢測上游引物IrrE-up：5′- ATCCCTGTTAAGCTCCCATTCG-3′以及下游引物IrrE-down：5′-GACGGGTTCGGGCATCAAA-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μL：1 μL模板DNA，2 μL 10×Taq buffer，2 μL dNTPs，引物各1 μL，0.2 μL Taq聚合酶，加滅菌水補齊至終體積。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增片段用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3生理生化指標(biāo)的檢測

1.3.1粗酶液的提取稱取2 g植物葉片，置于預(yù)冷的研缽中，加入少量的石英砂和預(yù)冷的4 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液（pH值7.0，含1%PVP、0.1%巰基乙醇）于冰浴上研磨成勻漿，全部轉(zhuǎn)入5 mL干凈的離心管中，于4 ℃、13 000 g離心 10 min，將上清液分裝至干凈的1.5 mL離心管中，保存于 -20 ℃ 備用。

1.3.2抗氧化酶活性的檢測過氧化物酶（peroxidase，POD）活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[8]，以1 min D470 nm變化001為1個酶活性單位[U/（g·min）]；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的檢測采用氮藍四唑（NBT）法[9]，以抑制NBT光還原50%作為1個酶活性單位（U/g）；過氧化氫酶（catalase，CAT）活性的檢測采用H2O2法[10-11]，以25 ℃下100 s內(nèi)在反應(yīng)體系中分解50% H2O2的酶量作為1個酶活性單位 （U/g）。

1.3.3其他生理生化指標(biāo)的檢測丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定用硫代巴比妥酸（TBA）比色法[12]；細胞膜透性的測定用相對電導(dǎo)率（REC）法[13]；脯氨酸與可溶性糖含量的測定分別用酸性茚三酮比色法[14]和蒽酮比色法[15]。

1.4數(shù)據(jù)處理

采用SAS 8.0 和Excel對數(shù)據(jù)進行分析處理及作圖。

2結(jié)果與分析

2.1IrrE基因的PCR檢測

對T3代轉(zhuǎn)基因油菜植株進行PCR檢測，結(jié)果（圖1）表明，轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA均擴增出與陽性質(zhì)粒（對照）同樣大小的目的片段（396 bp），而非轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA未擴增出條帶。

2.2過表達IrrE基因提高油菜植株葉片抗氧化酶活性

隨著NaCl濃度的增加，轉(zhuǎn)基因油菜植株與非轉(zhuǎn)基因油菜植株的抗氧酶活性均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，但前者的抗氧酶活性高于后者的活性（圖2）。在0、100、150 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因油菜植株與非轉(zhuǎn)基因油菜植株P(guān)OD活性和SOD活性差異不顯著；但在200、250、300、350 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因油菜植株的POD活性和SOD活性均顯著高于非轉(zhuǎn)基因油菜植株，其中轉(zhuǎn)基因油菜植株的POD活性比非轉(zhuǎn)基因油菜植株分別高17.6%、17.9%、56.0%、572%，轉(zhuǎn)基因油菜植株的SOD活性比非轉(zhuǎn)基因油菜植株分別高出17.3%、46.0%、57.2%、54.3%。在0～150 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因油菜植株的CAT活性與非轉(zhuǎn)基因油菜植株差異不顯著；但在200、250、300、350 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因油菜植株的CAT活性顯著高于非轉(zhuǎn)基因油菜植株，分別高12.4%、22.6%、63.3%、104.0%。

2.3過表達IrrE基因提高油菜植株葉片在高鹽脅迫下細胞的滲透調(diào)節(jié)能力

在0～300 mmol/L NaCl脅迫下，盡管轉(zhuǎn)基因油菜植株可溶性糖含量與非轉(zhuǎn)基因油菜差異不顯著，但轉(zhuǎn)基因油菜植株的可溶性糖含量在不同濃度下都高于非轉(zhuǎn)基因油菜植株；在350 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因油菜植株的可溶性糖含量顯著高于非轉(zhuǎn)基因油菜植株，前者比后者高14.8%（圖3-A）。轉(zhuǎn)基因油菜植株的脯氨酸含量在250、300、350 mmol/L NaCl脅迫下極顯著地高于非轉(zhuǎn)基因油菜植株，分別高19.6%、532%、21.9%；在0～200 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因油菜植株與非轉(zhuǎn)基因油菜的脯氨酸含量差異不顯著，但轉(zhuǎn)基因油菜植株的脯氨酸含量仍然高于非轉(zhuǎn)基因油菜植株（圖3-B）。

2.4過表達IrrE基因提高油菜植株葉片在鹽脅迫下細胞膜的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

隨著鹽濃度的增加，轉(zhuǎn)基因油菜植株和非轉(zhuǎn)基因油菜植

株的MDA含量和REC均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，但前者增加幅度小于后者（圖4）；在0、100 mmol/L NaCl脅迫下，二者的MDA含量和REC差異不顯著；在150、200、250、300、350 mmol/L NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因油菜植株的MDA含量和REC顯著低于非轉(zhuǎn)基因油菜植株，轉(zhuǎn)基因油菜植株的MDA含量分別低于非轉(zhuǎn)基因油菜植株20.0%、38.3%、23.8%、22.5%、20.8%（圖4-A），而轉(zhuǎn)基因油菜植株的REC分別低于非轉(zhuǎn)基因油菜植株13.2%、20.2%、22.2%、31.1%、252%（圖4-B）。

3結(jié)論與討論

鹽脅迫會使植物細胞形成滲透和離子脅迫，且細胞質(zhì)會積累一些小分子的有機物如脯氨酸、可溶性糖、甜菜堿等來緩解滲透脅迫[16-17]。在本研究中，在高濃度（250、300、350 mmol/L）NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株葉片的脯氨酸含量和可溶性糖含量均明顯高于對照，說明過表達IrrE能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因植株葉片脯氨酸和可溶性糖量的積累，維持細胞內(nèi)外的滲透平衡，減少細胞因滲透脅迫而造成的功能降低。

非生物脅迫下，植物體內(nèi)形成大量的活性氧，如氫氧根負離子（OH—）、自由羥基（·OH）、過氧化氫（H2O2）等[18]。這些活性氧不及時清除就會損傷植物細胞，尤其是造成細胞質(zhì)膜的過氧化；相應(yīng)地，植物體內(nèi)有一個活性氧清除體系，產(chǎn)生的活性氧能及時被植物體內(nèi)抗氧化酶清除，這些抗氧化酶主要有SOD、CAT、POD、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）、脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）等[19]。植物的抗氧化酶活性越高，清除活性氧的能力越強，植物抗非生物脅迫的能力就越強[20]。本研究中，在高濃度（200、250、300、350 mmol/L）NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化酶活性（SOD、CAT、POD）均明顯強于對照，而低濃度（100、150、200 mmol/L）NaCl脅迫下，差異雖不明顯，但轉(zhuǎn)基因的抗氧化酶活性均高于非轉(zhuǎn)基因。說明過表達IrrE能夠增強轉(zhuǎn)基因植株的抗氧化酶活性，增強植株清除活性氧的能力。這可能是由于IrrE基因作為一個全局調(diào)控因子，能調(diào)節(jié)油菜多種抗逆基因的高表達，如SOD、CAT基因等[7]。

在鹽脅迫下，植物葉片最先受到破環(huán)的是細胞膜，大量的活性氧導(dǎo)致質(zhì)膜過氧化產(chǎn)生MDA以及電解質(zhì)大量外滲，進而細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性遭到破壞[21]。本研究中，高濃度（200、250、300 mmol/L）NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株MDA含量和REC均顯著低于非轉(zhuǎn)基因，說明過表達IrrE通過增強抗氧化酶活性來清除高濃度鹽脅迫形成的活性氧，減輕質(zhì)膜的損傷程度，維持膜結(jié)構(gòu)的完整性。

Pan等最早報道油菜中過表達IrrE能提高轉(zhuǎn)基因植株在高鹽脅迫下的存活能力[7]；奉斌等也曾報道在煙草中過表達IrrE能提高轉(zhuǎn)基因植株耐旱能力[22]；童仕波等發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過表達IrrE能提高轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫的耐受性[23]。本研究進一步證明了轉(zhuǎn)IrrE基因油菜的后代T3在高鹽濃度脅迫下，過表達IrrE能夠提高轉(zhuǎn)基因油菜植株的抗鹽脅迫能力。可見，IrrE在植物抵抗鹽脅迫和干旱脅迫中起重要作用，這為以后利用IrrE培育抗鹽作物新品種提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]Darwish T，Atallah T，El Moujabber M，et al. Salinity evolution and crop response to secondary soil salinity in two agro-climatic zones in Lebanon[J]. Agricultural Water Management，2005，78（1/2）：152-164.

[2]Luchli A，James R A，Huang C X，et al. Cell-specific localization of Na+ in roots of durum wheat and possible control points for salt exclusion[J]. Plant，Cell & Environment，2008，31（11）：1565-1574.

[3]王善仙，劉宛，李培軍，等. 鹽堿土植物改良研究進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2011，27（24）：1-7.

[4]陳莎莎，蘭海燕. 植物對鹽脅迫響應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[J]. 植物生理學(xué)報，2011，47（2）：119-128.

[5]Earl A M，Mohundro M M，Mian I S，et al. The IrrE protein of Deinococcus radiodurans R1 is a novel regulator of recA expression[J]. Journal of Bacteriology，2002，184（22）：6216-6224.

[6]Gao G，Tian B，Liu L，et al. Expression of Deinococcus radiodurans PprI enhances the radioresistance of Escherichia coli[J]. DNA Repair，2003，2（12）：1419-1427.

[7]Pan J，Wang J，Zhou Z F，et al. IrrE，a global regulator of extreme radiation resistance in Deinococcus radiodurans，enhances salt tolerance in Eschrichia coli and Brassica napus[J]. PLoS One，2009，4（2）：1-9.

[8]Polle A，Otter T，Seifert F. Apoplastic peroxidases and lignification in needles of Norway spruce （Picea abies L.）[J]. Plant Physiology，1994，106（1）：53-60.

[9]Beyer W F，F(xiàn)ridovich I. Assaying for superoxide dismutase activity：some large consequences of minor changes in conditions[J]. Analytical Biochemistry，1987，161（2）：559-566.

[10]Corbisier P，Houbion A，Remacle J. A new technique for highly sensitive detection of superoxide dismutase activity by chemiluminescence[J]. Analytical Biochemistry，1987，164（1）：240-247.

[11]Chen S，Chai M L，Jia Y F，et al. In vitro selection of glyphosate-tolerant variants from long-term callus cultures of Zoysia matrella[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2012（111）：199-207.

[12]趙世杰，許長成，鄒琦，等. 植物組織中丙二醛測定方法的改進[J]. 植物生理學(xué)通訊，1994，30（3）：207-210.

[13]王玉，孔凡英，尹波，等. 過表達單脫氫抗壞血酸還原酶基因提高番茄抗UV-B脅迫能力[J]. 植物生理學(xué)報，2014，50（1）：14-95.

[14]張蜀秋. 植物生理學(xué)實驗技術(shù)教程[M]. 北京：科學(xué)出版社，2011：187-188.

[15]王學(xué)奎. 植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M]. 北京：高等教育出版社，2006：202-204.

[16]Khatkar D，Kuhad M S. Short-term salinity induced changes in two wheat cultivars at different growth stages[J]. Biologia Plantarum，2000，43（4）：629-632.

[17]Singh S K，Sharma H C，Goswami A M，et al. In vitro growth and leaf compositon of grapevine cultivars as affected by sodium chloride[J]. Biologia Plantarum，2000，43（2）：283-286.

[18]Gill S S，Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2010，48（12）：909-930.

[19]Mittler R. Oxidative stress，antioxidants and stress tolerance[J]. Trends in Plant Science，2002，7（9）：405-410.

[20]葉曉霞，燕芳，龍海桂，等. 過表達ZmSKIP基因提高煙草抗低溫脅迫的能力[J]. 植物生理學(xué)報，2014，50（6）：797-800.

[21]王剛，肖強，衣艷君，等. 甘薯幼苗對NaCl脅迫的生理響應(yīng)及外源鈣的緩解效應(yīng)[J]. 植物生理學(xué)報，2014，50（3）：338-346.

[22]奉斌，代其林，劉婷婷，等. NaCl脅迫對轉(zhuǎn)IrrE基因煙草抗氧化酶活性的影響[J]. 吉林農(nóng)業(yè)C版，2010，63（6）：63-64.

[23]童仕波，文國琴，林敏，等. 轉(zhuǎn)耐輻射球菌irrE基因提高擬南芥鹽脅迫耐受性的表型分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2010，12（4）：90-94.錢善勤，龍茜，陳盼，等. 京尼平苷對玉米幼苗生長的促進作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（2）：108-110.