溶血3 項(xiàng)試驗(yàn)對(duì)于新生兒溶血病的診斷價(jià)值分析

冉柏林，李洪兵

在新生兒溶血病(HDN)的病因中，以母嬰血型不合引起的較為常見(jiàn)， 大部分是ABO 溶血病和Rh溶血病[1-2]。新生兒溶血病可導(dǎo)致患兒出現(xiàn)重度貧血、高膽紅素血癥及膽紅素腦病，如不及時(shí)診治，可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，嚴(yán)重患者可引起死亡[3]。 特別是由于ABO 血型抗原廣泛存在于自然界，母體雖未曾輸血或妊娠，但血清中可能已有IgG 抗體，故第一胎即可發(fā)病。新生兒ABO 溶血的確診需經(jīng)血型血清學(xué)檢查，證實(shí)母子ABO 血型不合，直接抗球蛋白試驗(yàn)陽(yáng)性或/和釋放抗體陽(yáng)性[4-7]。本研究采用微柱凝膠抗球蛋白試驗(yàn)(MGCT)檢測(cè)母嬰血型不合新生兒母親的IgG 血型抗體效價(jià)，同時(shí)進(jìn)行溶血病3 項(xiàng)試驗(yàn)，即游離抗體試驗(yàn)、抗體釋放試驗(yàn)和直接抗人球蛋白試驗(yàn)來(lái)分析其對(duì)于產(chǎn)后新生兒溶血病的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 以2012 年7 月～2014 年8 月我院收治的母嬰血型不合的高膽紅素新生兒604 例及其母親604 例為研究對(duì)象。新生兒母親納入標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)翁ト焉锓置洌蝗焉铮?2 w；血型為O 型，新生兒父親為非O 型血；知情同意本研究且簽署知情同意書(shū)。 母嬰血型不合的高膽紅素新生兒納入標(biāo)準(zhǔn)：研究期間無(wú)死亡；符合母嬰血型不合的高膽紅素的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；無(wú)先天性心血管疾病。 新生兒患兒中，男304例，女300 例；出生體重（2733.34±600.29）g；第1 胎504 例，第2 胎80 例，第3 胎20 例。 新生兒母親的平均年齡（25.09±4.29）歲；平均產(chǎn)次（2.09±1.11）次。

1.2 血型鑒定及直抗試驗(yàn) 采用MGCT 法，實(shí)驗(yàn)前將微柱凝膠卡取出，觀察有無(wú)干膠及氣泡，放置室溫中平衡15 min，離心2 min 備用。在新生兒母親血型鑒定中，取血型正反檢測(cè)卡1 張，在1～6 孔內(nèi)加入新生兒母親1%紅細(xì)胞懸液50 μl；7、8 孔先加入A、B 標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞各50 μl， 再加入新生兒母親血清50 μl，1500 r/min 離心8～10 min， 在顯微鏡下觀察判定結(jié)果。 在患兒血型鑒定中，取新生兒溶血病檢測(cè)卡1 張， 將患兒的紅細(xì)胞用生理鹽水配成1%的紅細(xì)胞懸液， 加入1～6 孔中，7、8 孔先加入A、B標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞各50 μl，1500 r/min 離心8～10 min，在顯微鏡下觀察判定結(jié)果。

1.3 游離抗體和抗體釋放試驗(yàn) 選擇新生兒的EDTA-K2 抗凝血3～5 ml，低溫離心分離血漿，用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞4 次，取0.5 ml 洗滌后的紅細(xì)胞置于干凈的EP 管中，取A 放散液400 μl 與B 放散液(大連Takara 公司)100 μl 混合均勻，加入0.5 ml的患兒洗滌紅細(xì)胞中， 室溫放置1 min；1500 r/min離心4 min 后， 將酸放散液轉(zhuǎn)移至另一只干凈的試管中， 加入紫紅色的中和液調(diào)至肉粉色，1500 r/min離心4 min 取上清液。 取新生兒溶血病檢測(cè)卡，1～3管分別加入50 μl 新生兒血清，4～6 管 分別加入50 μl 新生兒紅細(xì)胞放散液，將1%A 型紅細(xì)胞懸液分別加至1～4 號(hào)管中，1%B 型紅細(xì)胞懸液加入2～5號(hào)管中，1%O 型紅細(xì)胞懸液加入3～6 號(hào)管中；37 ℃孵育15 min，離心5 min，肉眼判定結(jié)果。

陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：紅細(xì)胞凝集塊位于微柱表面或凝膠中。 3 項(xiàng)試驗(yàn)中≥2 項(xiàng)陽(yáng)性或放散試驗(yàn)陽(yáng)性即可確診溶血病；放散陰性而直抗試驗(yàn)或游離試驗(yàn)陽(yáng)性為可疑；3 項(xiàng)均為陰性即可排除溶血病。

1.4 直接抗人球蛋白試驗(yàn) 取篩檢細(xì)胞50 μl，分別置于抗球蛋白檢測(cè)卡(上海生工公司)1～3 號(hào)孔內(nèi)，每孔加入50 μl 新生兒母親血清， 室溫孵育5 min，1500 r/min 離心5 min，肉眼觀察紅細(xì)胞留在微柱上端或分布在凝膠中為陽(yáng)性。 在新生兒母親IgG 抗體效價(jià)的檢測(cè)中， 取新生兒母親血清200 μl， 加入2-Me 應(yīng)用液200 μl，37 ℃水浴30 min。 取8 只滅菌試管，通過(guò)倍比稀釋，使IgG 抗體效價(jià)依次為1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048，將第3～8管已稀釋樣本50 μl 移至己標(biāo)記的抗人球蛋白試劑卡中，再分別加入50 μl 患兒父親1%紅細(xì)胞懸液。室溫孵育15 min，卡式離心機(jī)離心5 min(1500 r/min。依據(jù)試劑盒（上海生工公司）判斷標(biāo)準(zhǔn)[3]判定結(jié)果，ABO系統(tǒng)抗體效價(jià)＞1:64 為陽(yáng)性；Rh 系統(tǒng)抗體效價(jià)≥1:32 為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選擇SPSS14.00 軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2分析，相關(guān)性分析采用Pearson 直線相關(guān)分析，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 母親IgG 血型抗體效價(jià)與新生兒溶血病的關(guān)系 IgG 血型抗體效價(jià)陽(yáng)性新生兒母親487 例，陽(yáng)性率為80.6%； 新生兒溶血病的患病率為40.6%(245/604)，其中A 型溶血病的患病率為41.7%，B 型溶血病的患病率為39.8%， 對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05，表1)。

表1 A型與B型血新生兒溶血病的患病率對(duì)比（例)

2.2 溶血3 項(xiàng)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 在245 例新生兒溶血病患兒中，溶血3 項(xiàng)試驗(yàn)陽(yáng)性率在A 型與B 型血型之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05，表2)。

2.3 母親IgG 血型抗體效價(jià)與新生兒溶血病的關(guān)系 Pearson 直線相關(guān)分析結(jié)果顯示， 母親IgG 血型抗體效價(jià)與新生兒溶血病的患病率呈正相關(guān)(r =0.972，P ＜0.05，表3)。

表2 新生兒溶血病患兒溶血3項(xiàng)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

表3 新生兒母親lgG血型抗體效價(jià)與新生兒溶血病的關(guān)系

3 討論

新生兒溶血病是母嬰血型不合而產(chǎn)生同族血型的免疫性溶血，是新生兒病理性黃疸常見(jiàn)原因之一[8]，其主要發(fā)生在O 型血母親，而血型為A 型或B型的新生兒中[9]。 研究顯示，O 型血母親在孕前常已受其他原因的刺激使機(jī)體產(chǎn)生IgG 抗A、抗B 抗體，懷孕后這類(lèi)抗體通過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒體內(nèi)可引起溶血[10]。 新生兒溶血病臨床表現(xiàn)的輕重程度與母體相應(yīng)抗體的量、抗體和胎兒紅細(xì)胞的結(jié)合程度以及胎兒、新生兒的代償能力有關(guān)。 近年來(lái)，由于溶血3 項(xiàng)檢查及靜脈注射免疫球蛋白的應(yīng)用，新生兒溶血病多能早期診斷，及時(shí)治療，減少了膽紅素腦病和死亡病例的發(fā)生。 溶血3 項(xiàng)試驗(yàn)是早期診斷新生兒溶血的金標(biāo)準(zhǔn)， 新生兒早檢測(cè)溶血檢測(cè)3 項(xiàng)試驗(yàn)，并結(jié)合檢測(cè)結(jié)果做出正確診斷和及時(shí)治療，可以避免病情進(jìn)一步發(fā)展[11]。在新生兒溶血3 項(xiàng)試驗(yàn)檢測(cè)中，直接抗人球蛋白試驗(yàn)陽(yáng)性說(shuō)明患兒體內(nèi)的紅細(xì)胞可能被抗體致敏[12]；游離抗體試驗(yàn)是檢測(cè)新生兒血清中是否存在與其紅細(xì)胞不配合的ABO 以外的抗體和(或)IgG 抗A(B)抗體，主要提示病情的嚴(yán)重程度；抗體釋放試驗(yàn)的敏感性最高，多為100.0%[2]。

新生兒溶血可發(fā)生在胎兒期和新生兒早期。 在胎兒期溶血形成的膽紅素能迅速被母體肝臟代謝。而出生后由于溶血繼續(xù)存在，可導(dǎo)致新生兒高膽紅素血癥[13]。近年來(lái)，孕婦IgG 血型抗體效價(jià)檢測(cè)已成為產(chǎn)前檢查的常規(guī)項(xiàng)目[14]。文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)母體血清中IgG 抗A(B)抗體效價(jià)＞1:64 時(shí)，有可能使新生兒發(fā)生溶血；如果IgG 抗A(B)抗體效價(jià)≥1:128 時(shí)，提示新生兒可能受到損害；如果IgG 抗A(B)抗體效價(jià)≥1:512 時(shí)，則新生兒必然受到損害，必須進(jìn)行臨床預(yù)防性治療[15]。本研究結(jié)果顯示，母親IgG 血型抗體效價(jià)陽(yáng)性(≥1:64)率為80.6%，新生兒溶血病的患病率為40.6%；Pearson 直線相關(guān)分析顯示，IgG 血型抗體效價(jià)與溶血病的患病率呈正相關(guān)(P ＜0.05)。 證實(shí)當(dāng)母親IgG 抗體效價(jià)顯著升高時(shí)， 新生兒溶血病患病率將顯著增加，臨床應(yīng)采取相應(yīng)的預(yù)防措施，并做好積極治療方案準(zhǔn)備。

總之，溶血3 項(xiàng)試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)新生兒溶血病具有很好的預(yù)測(cè)及早期診斷效果，應(yīng)作為臨床產(chǎn)前檢查的常規(guī)項(xiàng)目之一； 對(duì)于IgG 血型抗體效價(jià)陽(yáng)性的產(chǎn)婦，應(yīng)做好新生兒溶血病的積極治療方案準(zhǔn)備。

[1] 蔡銀吉,魏繼梅.新生兒溶血病與其母親血型抗體效價(jià)關(guān)系分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2011,8(22)：119-211.

[2] 史長(zhǎng)宏,李存宇,曹宗新,等.新生兒溶血病檢測(cè)試驗(yàn)多樣性與膽紅素水平相關(guān)性研究[J].中國(guó)臨床實(shí)用醫(yī)學(xué),2010,4(5)：24-26.

[3] Cohen DN, Johnson MS, Liang WH, et al. Clinically significant hemolytic disease of the newborn secondary to passive transfer of anti-D from maternal RhIG [J]. Transfusion, 2014,54(11)：2863-2866.

[4] 張輝,李志武,王秀明,等.ABO 新生兒溶血病血清學(xué)檢測(cè)相關(guān)影響因素分析[J].中國(guó)婦幼保健,2013,28(13)：145-146.

[5] 楊文勇,和潤(rùn)濘,蔡德康,等.血型血清學(xué)診斷ABO 新生兒溶血病的實(shí)驗(yàn)研究[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐,2012,25(8)：78-80.

[6] 賈金平,汪莎,王沛,等.臍帶血在ABO 新生兒溶血病早期診斷的研究[J].中國(guó)婦幼保健,2013,28(36)：123-125.

[7] Higel L, Froehlich C, Pages MP, et al. Macrophage activation syndrome and autoimmunity due to visceral leishmaniasis[J].Arch Pediatr,2015,22(4)：397-400.

[8] 胡素瑾. 血型O 型產(chǎn)婦604 例ABO 及Rh 血型抗體效價(jià)檢測(cè)[J].中國(guó)臨床研究,2014,27(5)：49-51.

[9] 何子毅,劉赴平,胡應(yīng)明,等.RhD 陰性產(chǎn)婦妊娠RhD 陽(yáng)性胎兒與新生兒溶血病的相關(guān)性分析[J].重慶醫(yī)學(xué),2012,41(8)：45-46.

[10] Wolanin SA, Demain JG, Meier EA. Successful desensitization of a patient with aplastic anemia to antithymocyte globulin [J].Allergy Rhinol (Providence),2015,6(1)：64-67.

[11] 符寶銘，石明芳，袁茜茜.新生兒溶血病壯族患兒ABO 三項(xiàng)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志.2012,33(6)：704-705.

[12] 甘志遠(yuǎn),蘇國(guó)紅,伍煥秀.ABO 溶血病新生兒178 例血清學(xué)檢測(cè)及其意義探討[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊,2013,4(6)：67-68.

[13] Thakkar D, Radhakrishnan N, Pruthi PK, et al. Kawasaki disease with autoimmune hemolytic anemia [J].Indian Pediatr,2015,52(3)：245-246.

[14] 王杰偉.310 例新生兒黃疸患兒血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果的分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2013,34(9)：109-111.

[15] 王麗,朱陽(yáng)泉,徐長(zhǎng)根,等.母嬰血型不合致新生兒溶血病231 例分析[J].臨床輸血與檢驗(yàn),2010,12(4)：321-322.