香格里拉地區山脈土壤微生物分布及藥敏結果

子建文，資云海，唐 輝，李 倩，張勝梅，李曉霞

高原地區土壤微生物分布已有報道，但云南高海拔地區土壤微生物調查報道較少，本研究對香格里拉地區遠離農戶、人群、農牧場的山脈土壤微生物的分布和藥敏情況進行了調查，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 樣地選擇 2014 年11 月中旬于香格里拉，樣地均為由稀疏灌木叢覆蓋的山坡地，且遠離農戶、人群、牧場10 km 以上，在香格里拉縣城的東南西北方向20 km 以外分別設置具有代表性的1、2、3 和4 號采樣點，經緯度分別是99°10′27″E27°29′18″N、99°24′31″E27°36′25″N、99°31′16″E27°32′9″N 和99°42′4″E27°49′2″N，海拔分別為3312、3185、3489 和3289 m，每個點分為陽坡和陰坡。

1.2 標本采集 按隨機布點法[1]，在每個采樣點的陽坡和其對應的陰坡分別以“Z”字型選取4 個點，除去地面植被和枯枝落葉，鏟除1 cm 左右的表土，挖好剖面后，燒灼法消毒取樣鏟，取深度為30 cm 的黃土，需氧標本放于無菌均質袋中，厭氧標本放入無菌厭氧袋內，標記后密封運送。 無菌均質袋由廣東環凱微生物科技有限公司提供。

1.3 培養與鑒定

1.3.1 需氧菌與真菌 稱取10 g 新鮮土壤，加入盛100 ml無菌水的500 ml 三角瓶內，振蕩10 min，使土壤均勻地分散在稀釋液中成為土壤懸液，吸取1 ml 土懸液到9 ml 無菌水中，按10 倍法依次稀釋，真菌稀釋105倍，細菌稀釋106倍。 取稀釋好的菌液傾注3 塊血平板(1 ml/塊)，置于37 ℃溫箱孵育48 h；真菌傾注3 塊沙氏培養基(1 ml/塊)，置于25 ℃溫箱孵育72 h，然后計數菌落，計算出土壤中微生物數量。 觀察平板上的菌落形態、顏色。 對生長的細菌進行革蘭染色，用TREK DLAGNOSTIC SYSTEMS LTD 全自動微生物鑒定儀（賽默飛世爾科技公司）進行細菌鑒定。 真菌鑒定根據肉眼觀察在沙氏培養基上生長形態及顯微鏡觀察真菌孢子形態。將性狀相同的菌類進行歸類。藥敏試驗采用美國臨床試驗室標準化研究所（CLSI）推薦的K-B 法，藥敏紙片由貝瑞特生物技術有限責任公司生產提供。

1.3.2 厭氧菌 將標本接種于9.0 cm 直徑的厭氧培養基中，置于35 ℃厭氧培養箱中培養48 h。采用法國梅里埃公司生產的VITEK 2 系統及其配套的測試卡進行鑒定和藥敏試驗。

1.4 質控菌株 大腸埃希菌ATCC-25922、 銅綠假單胞菌ATCC-27853、金黃色葡萄球菌ATCC-25923，購自云南省臨床檢驗中心。

1.5 統計學方法 采用SPSS19.0 軟件包分析數據，WHonet 5 軟件包對藥敏資料進行分析。 不同采樣點的陰坡或陽坡微生物數量之間比較用方差分析，同一采樣點的陽坡和陰坡之間比較用獨立樣本t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各采樣點微生物分布 4 個采樣點陽坡的細菌總數和真菌總數之間的差異無統計學意義（P ＞0.05），陰坡之間的差異亦無統計學意義（P ＞0.05），但4 個采樣點的陽坡與陰坡的微生物總數均存在統計學差異（P ＜0.05），即細菌（或真菌）總數陰坡＞陽坡（見圖1、2）。

2.2 各采樣點微生物構成 各種細菌或真菌在不同采樣點的構成比無統計學差異（P ＞0.05）；各采樣點的厭氧菌構成比無統計學差異（P ＞0.05），但革蘭陰性菌、革蘭陽性菌及真菌構成比有統計學差異（P ＜0.05），革蘭陰性菌＞革蘭陽性菌＞厭氧菌＞真菌（表1）。

圖1 各采樣點陰陽面土壤中細菌數均值

圖2 各采樣點陰陽面土壤中真菌數均值

表1 香格里拉不同采樣點土壤中微生物構成[株(%)]

表2 香格里拉土壤中革蘭陰性菌對常用抗生素藥物的敏感率[株（%）]

表3 香格里拉土壤中革蘭陽性菌對常用抗生素藥物的敏感率[株(%)]

表4 香格里拉土壤中厭氧菌對常用抗生素藥物的敏感率[株(%)]

表5 香格里拉土壤中真菌對藥物的敏感率[株(%)]

2.3 革蘭陰性菌藥敏試驗 氨基糖苷類和半合成青霉素類抗生素敏感率較高，除嗜水氣單孢菌對阿米卡星敏感率為85.7%外，其余均為100.0%；喹諾酮類中，左氧氟沙星對所鑒定的細菌全敏感， 其余細菌敏感性在75.3%～100.0%之間。頭孢菌素中，革蘭陰性菌對頭孢哌酮/舒巴坦敏感率100.0%；其次是頭孢噻吩和頭孢唑啉，敏感率大于85.7%； 除銅綠假單胞菌和棲稻黃色單胞菌敏感率介于76.5%～82.9%外，其余細菌對頭孢曲松和頭孢呋辛鈉敏感率均為100.0%； 而銅綠假單胞菌和棲稻黃色單胞菌對頭孢西丁敏感率100.0%， 其余細菌敏感率介于52.4%～56.5%之間。 革蘭陰性菌對碳青霉烯類敏感率51.8%～100.0%。 棲稻黃色單胞菌和嗜水氣單孢菌對復方新諾明敏感率100.0%，其余細菌敏感率介于75.9%～96%之間。嗜水氣單胞菌、 豚鼠氣單胞菌和河流弧菌對氨曲南敏感性100.0%，其余細菌介于50.6%～57.3%之間。 見表2。

2.4 革蘭陽性菌藥敏試驗 所分離得到的革蘭陽性菌對青霉素、氨芐西林、環丙沙星、米諾環素、妥布霉素、阿米卡星和萬古霉素普遍敏感，敏感率在97.4%以上；腐生葡萄球菌對所有抗生素敏感，未發現耐藥株。 見表3。

2.5 厭氧菌藥敏試驗 分離出的4 種厭氧菌對常用抗生素的敏感率在90.9%以上。 除壞名梭菌對氯霉素和青霉素敏感率為90.9%外，其余敏感率均為100.0%。 見表4。

2.6 真菌藥敏試驗 合成類抗生素、伏立康唑及伊曲康唑對4 種真菌全覆蓋， 敏感率均為100.0%。 真菌對克霉唑、特比萘芬的敏感率在90.0%以上。 見表5。

3 討論

高海拔地區具有獨特的自然地理環境，其主要特征是高寒、缺氧、日照時間長，輻射強，降水較少，相對干燥[2]。該區域山脈陰陽坡面在日照輻射、相對溫濕度等方面差異顯著，造成區域內微生物數量分布差異[3-5]。本試驗結果表明，香格里拉高海拔山脈陰坡面土壤中微生物數量大于陽坡。香格里拉高海拔山坡地域因其獨特的高原自然地理環境和人文環境，土壤污染小，土壤微生物數量明顯低于其他低海拔地區。

該區域4 個采樣點土壤微生物數量及構成比之間無顯著差異， 各點土壤中微生物以細菌為主， 平均占96.54%，真菌數量較少，平均占3.46%。細菌中革蘭陰性菌數量多于革蘭陽性菌；革蘭陰性菌中優勢菌為痢疾志賀菌（8.54%）、 棲稻黃色單胞菌 （8.16%）、 銅綠假單胞菌（7.87%）和侵肺巴斯德菌（7.97%），革蘭陽性菌中優勢菌為腐生葡萄球菌（14.59%）、蠟樣芽胞桿菌（14.59%）和蘇云金芽孢桿菌（8.54%）。

該區域土壤中微生物藥敏試驗結果表明，香格里拉高海拔山脈坡面土壤中細菌、 真菌對絕大多數抗生素敏感，高海拔山地環境中土壤微生物對常用抗生素的敏感性較低海拔地區高，其中厭氧菌僅檢出1 株耐氯霉素的壞名梭菌，其余菌株敏感率均為100%；但是也檢出對頭孢菌素、氨曲南及紅霉素等耐藥的菌株，說明長期廣泛使用此類抗生素，即使在遠離農戶、人群、牧場的高海拔區域，也已有耐藥菌株的存在。

高海拔地區自然災害和事故也時有發生，人員受傷不可避免，尤其是火器傷傷口創面可不同程度被空氣和土壤中的細菌污染，創面感染細菌的種類與受傷部位周邊存在的菌群有密切關系[6]，且感染以條件致病菌和耐藥菌株為多[7]。相關動物模型試驗表明，傷口早期感染細菌與所處環境細菌譜有交叉重疊[8]。 摸清此類地域土壤微生物本底狀況，為創傷感染細菌檢測和治療提供依據具有現實意義。

[1] 林先貴.土壤微生物研究原理與方法[M].北京：高等教育出版社, 2010：29-38.

[2] 王根春,李主一,安梅,等.西藏高原空氣、河水中細菌學調查報告[J].中國衛生檢驗雜志,1998,8(4)：226.

[3] 李曉玲,葛迪,高婷,等.某城市城區空氣細菌、真菌分布研究[J].西北國防醫學雜志,2013,34(6)：550.

[4] 方治國,歐陽志云,趙景柱,等.烏魯木齊城市空氣細菌群落結構與動態變化特征[J].微生物報,2006,46(4)：618.

[5] 張晟,鄭堅,付永川,等.重慶市城市空氣微生物污染及評價[J].環境與健康雜志,2002,19(3)：231.

[6] 姚詠明,盛志勇.膿毒癥防治學[M].北京：科學技術文獻出版社,2008：18-21.

[7] 王建,葛寶豐,劉興炎,等.豬肢體軟組織爆炸傷創面感染細菌譜及藥敏分析[J]. 解放軍預防醫學雜志,2008, 26(2)：118.

[8] 郭業彬,舒為群.軍事作業環境微生物與戰(創)傷感染[J].解放軍預防醫學雜志,2011,29(4)：306.