血府逐瘀湯中桔梗牛膝對血瘀大鼠芍藥苷藥代動力學的影響

黃 巍，熊 偉，唐 燦，毛旭華，由鳳鳴

引經理論始于金元時期， 在總結歸經理論的基礎上提出，稱引經藥能夠引導諸藥直達病所[1-2]。 血府逐瘀湯方出自王清任的《醫林改錯》，方中具有“引藥上行”的桔梗和“引血下行”的牛膝兩味引經藥。 方中赤芍的主要有效成分芍藥苷具有抑制血小板聚集、擴張血管等藥理作用[3-4]，與血府逐瘀湯方活血化瘀的功效方向一致。 本研究就血府逐瘀湯中引經藥的有無是否會影響方中有效成分芍藥苷的藥代動力學特性展開。 由于處于生理與病理狀態下大鼠體內芍藥苷的藥動學特性可能不同，故本研究采用血瘀模型大鼠分別灌胃同劑量（以芍藥苷計）的血府逐瘀湯全方（簡稱全方）、血府逐瘀湯缺桔梗方（簡稱單缺桔梗方）、血府逐瘀湯缺牛膝方（簡稱單缺牛膝方）、血府逐瘀湯缺桔梗牛膝方（簡稱缺桔梗和牛膝方）藥液，研究桔梗、牛膝的配伍對芍藥苷藥代動力學的影響，初步探討桔梗、牛膝的“引經作用”。

1 材料與方法

1.1 儀器 SPD-10Avp 型紫外-可見光檢測器（日本島津）；LC-10ATvp 型高效液相色譜儀（日本島津）；FA1004 型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)。

1.2 藥品和試劑 中藥飲片均購自四川本草堂藥業，經成都中醫藥大學張廷模教授鑒定合格。 芍藥苷對照品 （成都普菲德生物技術有限公司， 批號：121207，HPLC 含量≥98%）；核黃素對照品(成都植標化純生物技術有限公司， 批號：130114，HPLC 含量＞98%)；葡聚糖T500（北京雅安達生物技術有限公司，批號：F0115）；甲醇、乙腈為色譜純。

1.3 實驗動物 SD 大鼠24 只， 雌雄各半， 體重180～220 g，購自四川省中醫藥科學院，動物合格證號：SCXK(川)2013-19。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流動相為乙腈- 水（16:84），流速1.0 ml/min，檢測波長230 nm，核黃素為內標物，進樣量20 μl。

1.4.2 藥液制備 按全方、單缺桔梗方、單缺牛膝方、缺桔梗和牛膝方的處方劑量，分別稱取45 倍處方量藥材，加水10 倍量，浸泡30 min，煎煮3 次，30 min/次，合并過濾煎液，濾液轉移至旋轉蒸發器濃縮8 h，真空干燥箱干燥[5-6]，分別得全方、單缺桔梗方、 單缺牛膝方、 缺桔梗和牛膝方提取物粉末426、1054、948、650 g， 粉末 中 芍 藥 苷 含 量 分 別 為2290.35、2620.40、3365.82、3119.59 μg/g。 稱取提取物粉末各4.0 g，依次加入4.0、4.6、5.9、5.4 ml 水，攪拌使完全溶解，即得不同組方藥液。

1.4.3 溶液配制 芍藥苷工作液： 精密稱取芍藥苷對照品6.63 mg 于干燥棕色50 ml 容量瓶中，甲醇溶解定容， 搖勻即為對照品儲備溶液， 濃度為130.0 μg/ml。 取對照品儲備溶液適量， 用水稀釋成濃度為1.0 μg/ml，即得芍藥苷工作液。

內標工作液： 精密稱取核黃素對照品4.80 mg于干燥棕色50 ml 容量瓶中，70%甲醇溶解定容，搖勻即為內標儲備溶液，濃度為94.1 μg/ml。 取內標儲備溶液適量，用水稀釋60 倍即得內標工作液，濃度為1.57 μg/ml。

5%葡聚糖T500 溶液： 精密稱取葡聚糖T500 0.2 g 加入0.9%氯化鈉注射液4.0 ml，水浴加熱并攪拌，使其完全溶解，溶液呈無色透明，0 ℃冷藏備用。

1.4.4 動物分組、造模與給藥 24 只大鼠禁食12 h，自由飲水。采用5%葡聚糖T500 溶液，按2 ml/kg尾靜脈推注[7]，建立血瘀模型。 30 min 后，將模型大鼠隨機分為全方組、單缺桔梗方組、單缺牛膝方組、缺桔梗和牛膝方組，每組6 只，雌雄各半。按5 ml/kg體重，相應灌胃全方、單缺桔梗方、單缺牛膝方、缺桔梗和牛膝方藥液，以芍藥苷計灌胃劑量為11.452 mg/kg。

1.4.5 檢測 分別于灌胃后10 min、15 min、30 min、45 min、1.5 h、2.5 h、4 h，自大鼠眼眶靜脈叢取血，靜置10～20 min，5000 r/min 離心10 min，取血清100 μl，加入乙腈250 μl、 內標工作液20 μl，2000 r/min 旋渦沉淀蛋白，5000 r/min 離心10 min， 轉移上清液，40 ℃水浴通氮吹干，100 μl 水復溶，20 μl 進樣，高效液相色譜儀檢測芍藥苷的含量[8]。

1.5 統計學方法 運用SPSS13.0 軟件分析，實驗數據以±s 表示，藥動學參數AUC(0-t)、Cmax取自然對數后進行單因素方差分析，Ka、Ke、Tmax、t1/2進行非參t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

各組大鼠灌胃后，按“1.4.5 檢測”項下檢測，記錄色譜圖， 芍藥苷與內標物的峰面積比值代入標準曲線方程，計算出血清中芍藥苷濃度(圖1)。藥時曲線數據經DAS2.0 軟件擬合藥代動力學參數(表1)?；谌苯酃：团Ｏシ剑?芍藥苷藥動學參數直接比較后結果為：單缺牛膝方能增大芍藥苷Ke，減小AUC(0-t)、Ka、Cmax、Tmax、t1/2；單缺桔梗方能增大芍藥苷AUC(0-t)、Tmax、t1/2，減小Ka、Ke、Cmax；全方能增大Ke、Cmax，減小AUC(0-t)、Ka、Tmax、t1/2。

3 討論

引經藥桔梗被稱為能“載藥上行”，引經藥牛膝被稱為能“引血下行”。 桔梗、牛膝作為引經藥使用，能否影響芍藥苷的藥代動力學特性？ 兩味引經藥的作用一升一降，配伍使用后“引經作用”減弱或加強？基于缺桔梗和牛膝方，藥動學參數直接比較發現：單缺牛膝方和單缺桔梗方對芍藥苷的Ke、AUC(0-t)、Tmax、t1/2的影響趨勢相反， 對參數Ka、Cmax的影響趨勢同為減小；桔梗、牛膝配伍使用(全方)對參數Ka、Cmax的影響趨勢變為增大，對參數AUC(0-t)、Tmax、t1/2的影響趨勢同單缺牛膝方。 然而，藥動學參數統計比較發現：參數AUC(0-t)、Ka、Cmax組間差異無統計學意義；全方組Ke 明顯大于單缺桔梗方組、 缺桔梗和牛膝方組(P ＜0.05)；全方組t1/2明顯小于單缺桔梗方組、缺桔梗和牛膝方組(P ＜0.05)；單缺桔梗方組Tmax明顯大于全方組、單缺牛膝方組(P ＜0.05)。 因此，本實驗結果說明：桔梗、牛膝作為引經藥的使用，確能影響芍藥苷部分藥代動力學參數；桔梗、牛膝配伍明顯影響芍藥苷的Ke，使“引經作用”加強。

圖1 血瘀大鼠灌胃不同組方藥液后藥時曲線(n=6)

有學者認為，應立足于中藥在體內發揮作用的各關鍵環節，展開“引經作用”的探討[9]。 根據本實驗結果，擬從芍藥苷在體內“吸收- 分布- 消除”過程，對桔梗、牛膝引經作用機理進行假設：桔梗和牛膝中某些成分與芍藥苷在體內存在既競爭又促進的關系。 吸收過程(Ka、Cmax、Tmax)：單缺牛膝方和單缺桔梗方主要表現為競爭吸收； 桔梗牛膝配伍使用(全方)，主要表現為促進吸收。所以，血瘀大鼠灌胃全方后，Ka、Cmax都高于任何一個缺引經藥方， 而Tmax都不高于任何一個缺引經藥方。 血瘀大鼠灌胃單缺桔梗方或單缺牛膝方，Ka、Cmax都低于缺桔梗和牛膝方。 分布過程(V)：給藥途徑為灌胃，F 未知，表觀分布容積(V)和清除率(CL)都未知，但V/F 灌胃全方后最小，表明引經藥能影響芍藥苷的體內分布。 消除過程(Ke)：桔梗和牛膝中的某些成分和芍藥苷可能表現為競爭關系， 如這些成分更易與血中蛋白結合，使血中游離芍藥苷增多，芍藥苷就更易被消除，故血瘀大鼠灌胃全方、 單缺牛膝方后，Ke 高于缺桔梗和牛膝方；這些成分與芍藥苷也可能表現為促進關系，如促進游離芍藥苷向組織臟器轉移，使芍藥苷消除變慢， 故血瘀大鼠灌胃單缺桔梗方后，Ke 低于缺桔梗和牛膝方。

本研究證實了桔梗、牛膝的引經作用，并從“吸收-分布-消除” 過程展開了引經作用機理的設想。雖不能揭示具體的引經作用機理，但表明需從吸收部位、血中蛋白結合、組織分布、代謝部位、排泄途徑等角度來進一步研究引經作用機理。

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[7] 李儀奎.中藥藥理實驗[M].上海：科學技術出版社，1991：141-146.

[8] 黃巍，熊偉，唐燦，等.血府逐瘀湯中芍藥苷在大鼠體內的藥代動力學特性[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21(15)：41-44.

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