柴芍胃炎顆粒對胃潰瘍大鼠黏膜細胞因子的影響

李　兵，肖國輝，馮　雯，王天剛，曾　俊，向　未，楊偉興（.四川醫科大學03級研究生，四川　瀘州　646000；.四川醫科大學附屬中醫院脾胃病科，四川　瀘州　646000）

柴芍胃炎顆粒對胃潰瘍大鼠黏膜細胞因子的影響

李兵1，肖國輝2，馮雯1，王天剛2，曾俊2，向未2，楊偉興2
（1.四川醫科大學2013級研究生，四川瀘州646000；2.四川醫科大學附屬中醫院脾胃病科，四川瀘州646000）

［摘要］目的：研究柴芍胃炎顆粒對胃潰瘍愈合的影響，并探討其機制。方法：40只wistar大鼠，隨機分為正常組、模型組、奧美拉唑組、柴芍胃炎顆粒組（簡稱胃炎顆粒組），采用改良Takagi法制作乙酸胃潰瘍大鼠模型，治療13天后測量各組潰瘍指數，用免疫組化法檢測胃黏膜細胞Bcl-2、NF-κB蛋白的陽性密度。結果：柴芍胃炎顆粒組與其他組比較潰瘍指數明顯降低（P＜0.01），柴芍胃炎顆粒組與奧美拉唑組Bcl-2的表達明顯高于模型組（P＜0.01），且柴芍胃炎顆粒組高于奧美拉唑組（P＜0.01）。柴芍胃炎顆粒組NF-κB的表達明顯低于模型組（P＜0.01）。結論：柴芍胃炎顆粒能通過提高Bcl-2抑制細胞凋亡、降低NF-κB蛋白的表達促進潰瘍愈合，并可能是其促進潰瘍愈合機制之一。

［關鍵詞］柴芍胃炎顆粒；胃潰瘍；BCl-2；NF-κB；實驗研究

［Abstract］Objective：To study the protective effect of Chaishao Weiyan Granules on gastric ulcer of rats and its effective mechanism. Method：40 healthy wistar rats were randomly divided into model group，Chaishao Weiyan Granules group，omeprazole treatment group and normal group. The rat model of gastric ulcer was made by Takagi’s method with some modification. After the rats were treated for 13 d，the index of each group of ulcer and the expression of Bcl-2 and NF-κB in the gastric ulcer tissues was examined by immunohistochemical method. Result：Chaishao Weiyan Granules group could obviously decrease the ulcer index more than the others group（P＜0.01）. Compared with that of the model group，the expression of Bcl-2 in Chaishao Weiyan Granules group and omeprazole group was significantly higher（P＜0.01）and that of Chaishao Weiyan Granules group was higher than that of omeprazole group（P＜0.01）.The expression of NF-κB Chaishao Weiyan Granules group was significantly lower than that of the model group（P＜0.01）.Conclusion：Chaishao Weiyan Granules could increase Bcl-2 to inhibit apoptosis and reduce the expression of NF-κB protein to promote ulcer healing，which may be one of the mechanisms to promote ulcer healing.

［Key Words］Chaishao Weiyan Granules；Gastric ulcer；Bcl-2；NF-κb；Experimental study

消化性潰瘍（peptic ulcer，PU）是常見的消化系統疾病，人群中患病率高達5%～10%［1］，且95%的消化性潰瘍發生在胃和十二指腸。中醫藥治療消化性潰瘍具有多靶點、多途徑的［2］獨特優勢。本文采用免疫組化的方法，觀察柴芍胃炎顆粒治療大鼠實驗性胃潰瘍的效果，及其對胃黏膜細胞Bcl-2、NF-κB表達的影響，探討其治療胃潰瘍的作用機制。

1　實驗材料

動物：清潔級Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質量（190±40）g，由四川醫科大學實驗動物中心提供。動物合格證號為SYXK（川）2013-065。

藥物：柴芍胃炎顆粒。藥物組成為柴胡、白芍、黃連、吳茱萸、丹參、延胡索、枳殼等。采用中藥免煎顆粒，每袋10g，由四川醫科大學附屬中醫院制劑室提供（生產批號：川藥制字Z20080300），奧美拉唑膠囊（悅康藥業集團有限公司生產，生產批號14340346）。

儀器與試劑：熒光正置顯微鏡（日本Nikon80i），戊巴比妥鈉粉劑（武漢博士德有限公司），GTVISION TMⅠ型免疫組化檢測試劑盒（基因科技上海有限公司），NF-κB、Bcl-2免疫組織化學染色抗體試劑盒（abcam艾博抗上海貿易有限公司）。以上試劑均按照試劑盒說明書制備和使用。

2　實驗方法

分組及模型制備：將40只wistar大鼠隨機分為4組，分別是正常對照組、病理模型組、胃炎顆粒組、奧美拉唑組，每組各10只，除正常對照組外，余3組按照Takagi［3］方法改良造模，造模前大鼠禁食24h，不禁水，用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥固定于解剖板上，腹壁劍突下剪毛，常規消毒鋪巾，從劍突下縱向剪開腹壁約3cm，沿腹白線剪開腹壁，打開腹腔，可見腹部器官，以無齒鑷沿肝臟后找出胃，0.25mL注射器在胃竇前壁近小彎側注入0.03mL100%乙酸，達胃壁肌層與漿膜層之間（進針約0.4～0.5mm）［4］。2mL青霉素腹腔沖洗，以縫合線將腹膜、腹壁各層組織間斷縫合，再間斷縫合皮膚。

動物分組及喂藥：造模后第3天開始給藥，奧美拉唑組予奧美拉唑溶液，濃度為0.4mg/mL，按1mL/100g灌胃，日1次；胃炎顆粒組給予1.25g/mL，按1mL/100g灌胃，日1次；正常對照組、模型組灌喂生理鹽水，按1mL/100g灌胃，日1次。

標本采集及處理：灌胃13天后停藥，各組大鼠禁食24h，頸椎脫臼法處死；剪開大鼠腹腔，分別結扎幽門、賁門端后取出胃，沿胃大彎剪開，冰生理鹽水沖洗，以潰瘍瘢痕平行于胃長軸方向的最長徑為中心取材，迅速置于4%中性多聚甲醛中固定24h。按照常規脫水、二甲苯透明、石蠟包埋5μm厚度，以瘢痕的最長徑為中心連續切片。

檢測指標及方法：根據文獻報道方法，用分規測量潰瘍體積，潰瘍長度為潰瘍的最大直徑，寬度為與直徑垂直的最寬距離［5］。潰瘍面積=長×寬，深度按大于或小于2mm計算。潰瘍體積仿Okabe法［6］，用潰瘍指數（ulcer index，UI）表示，分10級。見表1。

表1　大鼠潰瘍指數計算方法

免疫組化染色法：操作方法按照試劑盒說明書。其檢測結果判定棕黃色顆粒為細胞漿或細胞核陽性表達。染色后運用計算機圖像分析儀（Motic images軟件系統）進行圖像半定量分析測定，每組隨機抽取5只大鼠切片各1張，每張隨機選取5個視野進行積分光密度值（integrated o ptical dens ity，IOD）測量。

統計學處理：用SPSS22.0統計軟件進行方差分析，數據以均數±標準差（±s ）表示。多組均數比較采用ANOVA檢驗，組間比較采用非配對t檢查，P＜0.05為差異有統計學意義。

3　實驗結果

3組潰瘍指數測定結果比較見表2。

表2　3組潰瘍指數測定結果比較 （mm2，±s）

表2　3組潰瘍指數測定結果比較 （mm2，±s）

組 別　n 　　潰瘍指數模型組　10　17.31±0.59奧美拉唑組　10　8.95±0.35△胃炎顆粒組　10　6.49±0.18△*

注：與模型組比較，△P＜0.01；與奧美拉唑組比較，*P＜0.01。

形態學觀察免疫組化染色顯示，在正常對照組大鼠胃黏膜上皮細胞中，可見Bcl-2蛋白表達較強，主要集中在腺管內，并且表達顆粒較粗；而在胃炎顆粒組中，Bcl-2蛋白陽性表達主要集中在胃黏膜底部，黏膜表層較弱。各組大鼠胃黏膜上皮細胞Bcl-2蛋白的陽性密度結果比較見表3。

表3　各組大鼠黏膜上皮細胞Bcl-2蛋白的陽性密度結果比較（%，±s）

表3　各組大鼠黏膜上皮細胞Bcl-2蛋白的陽性密度結果比較（%，±s）

注：與模型組比較，△P＜0.01；與奧美拉唑組比較，*P＜0.01。

組 別　n 　　陽性密度正常組　10　24.20±0.34模型組　10　12.17±0.56奧美拉唑組　10　14.57±0.32胃炎顆粒組　10　22.01±0.36△*

形態學觀察正常組大鼠，胃黏膜細胞胞漿中有NF-κB蛋白表達，胞核未見明顯表達。造模13d，模型組隨著潰瘍的愈合，再生黏膜胞漿、胞核均有表達，此時NF-κB蛋白具有失活和活化兩種狀態；而胃炎顆粒組和奧美拉唑兩組中，核染色均不及模型組，染色部位主要以胃黏膜腺上皮細胞胞漿為主。

各組大鼠胃黏膜NF-κB蛋白的陽性密度結果比較見表4。

表4　各組大鼠黏膜上皮細胞NF-κB蛋白陽性密度結果比較 （%，±s）

表4　各組大鼠黏膜上皮細胞NF-κB蛋白陽性密度結果比較 （%，±s）

注：與模型組比較，△P＜0.01。

組 別　n 　　陽性密度正常組　10　 0.33±0.40模型組　10　 5.40±0.07奧美拉唑組　10　 2.95±0.09△胃炎顆粒組　10　 2.80±0.04△

4　討　論

Bcl-2與凋亡密切相關，是目前研究較為透徹的一個基因家族。Bcl-2家族的成員通常以二聚體的形式發揮作用。在控制細胞生存和死亡中起重要作用［7］。很多研究發現細胞凋亡在潰瘍修復過程中也起著重要的調控作用［8］。細胞凋亡是涉及基因調控的復雜過程，其中Bcl-2可能是調控胃潰瘍胃黏膜上皮細胞凋亡的主要基因［9］。本實驗研究表明，潰瘍模型組中的Bcl-2基因蛋白表達明顯低于正常組，而柴芍胃炎顆粒組Bcl-2蛋白表達明顯增加。在潰瘍修復后，Bcl-2蛋白基本可恢復至正常水平表達。說明柴芍胃炎顆粒治愈胃潰瘍的機制與減少胃黏膜細胞的凋亡，增加抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表達有關。

NF-κB是參與炎癥反應的一個重要轉錄因子，在生理狀態下，它與κB抑制蛋白（IκB）結合以非活性狀態存在于細胞質中，當其受內毒素、氧自由基、細胞因子等的刺激后被激活，導致IκB磷酸化降解，NF-κB 與IκB解離，快速從細胞質移位進入細胞核內，通過自身核定位序列與相應的靶序列結合，調控相應的靶基因表達，調控多種炎癥因子轉錄進而調節炎癥進程，如調控黏附分子、前炎癥介質、趨化因子和一些炎性相關酶類的過度或持續表達，而使大量的炎性細胞積聚浸潤于炎癥部位，導致持續或放大的炎癥反應［10］。有研究表明，消化性潰瘍其胃黏膜上皮細胞NF-κB的活性是明顯增加的，且NF-κB陽性細胞數與炎癥程度呈明顯相關［11］。本實驗結果顯示，正常組大鼠胃黏膜有極少NF-κB陽性表達，乙酸誘導胃潰瘍后，胃黏膜NF-κB激活，引發胃黏膜炎癥反應，參與潰瘍發生，NF-κB活化表達與潰瘍指數呈正相關，提示其可能是影響潰瘍發生的關鍵因素之一。胃炎顆粒組和奧美拉唑組NF-κB表達明顯低于模型組，胃炎顆粒組潰瘍指數均顯示減低，說明柴芍胃炎顆粒可通過抑制NF-κB激活和表達，減輕過度炎癥反應，促進潰瘍愈合。

柴芍胃炎顆粒是我科已故四川名老中醫周德端教授的經驗方。方中柴胡具有解熱，抗炎，促進免疫功能；芍藥能抑制Hp，從而減輕炎癥，促進病變組織修復；黃連的主要成分為小蘗堿，抗菌譜廣，對Hp抑菌力較強，并能抗乙酰膽堿，有解痙鎮痛作用；丹參活血化瘀，通絡止痛，用丹參活血化瘀能增加黏膜組織的循環灌注促進其能量代謝，保證黏膜上皮及潰瘍底部和邊緣腺體迅速再生及保持黏膜微循環的酸堿平衡等，從而提高潰瘍愈合質量［12］。

本研究表明，柴芍胃炎顆粒對大鼠實驗性胃潰瘍療效顯著，通過提高胃黏膜組織中Bcl-2陽性表達以減少細胞凋亡，降低胃黏膜組織中NF-κB陽性表達，從而抑制炎癥反應，最終達到修復潰瘍的目的，可能是其促進潰瘍愈合的重要機制之一。

［參考文獻］

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［10］Chen FE，Huang DB，Chen YQ，et al.Crystal structure of p50 /65 heterodimer of transcription factor NF-κB bound to DNA［J］.Nature，1998，391（22）：410-413.

［11］Van DB，Ten FJ，Ponsioen CY，et al.Expression and activation of NF-κB in the antrum of the human stomach［J］.J Immunol，2000，164：3353.

［12］黃適，林壽寧，朱永萍，等.中西醫結合治療胃潰瘍臨床觀察［J］.遼寧中醫雜志，2003，30 （11）：928-929.

［收稿日期］2015-07-27

［通訊作者］楊偉興

［基金項目］瀘醫院科（2013）60號瀘州醫學院-瀘州醫學院附屬中醫院聯合基金課題

［中圖分類號］R256.337.31

［文獻標識碼］B

［文章編號］1004-2814（2015）12-1086-03