山羊絨DNA的提取及驗證

王玫+任亮+孔平+顏懷玉+肇慧君+楊春光

摘要

提取DNA是利用PCR技術檢測纖維的關鍵技術難點。本文對山羊絨DNA的提取方法進行了試驗，并通過PCR擴增的方法進行驗證。結果表明：使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 試劑盒，將纖維樣品盡量處理成粉末狀，并在樣品經裂解液處理后先離心除去其中尚未完全溶解的纖維，然后進行PCR擴增是比較有利的，完全能夠得到滿足PCR擴增要求的DNA樣品。

關鍵詞：山羊絨;DNA;提取方法;驗證

山羊絨是一種珍貴的動物纖維，山羊絨的價格比綿羊毛、馬海毛的價格高出很多倍，一些商家為了牟取利益，將細支綿羊毛、馬海毛等混紡產品冠以“純羊絨”的桂冠，使消費者上當[1]。目前羊絨羊毛纖維普遍采用的鑒別方法是投影儀法、掃描電鏡法，其原理為通過纖維的外觀形態、微觀結構辨別纖維種類，由于主觀因素大，準確率不高[2]。利用PCR技術鑒別動物纖維是近年來的研究熱點，而DNA的提取是利用PCR技術檢測纖維的關鍵技術難點。

毛發中的DNA主要集中在毛囊細胞中，毛干部分僅含有少量線粒體DNA[3]。在從動物體上采集或脫落的毛發中，絕大多數都帶有完整的毛囊[4]。王慶林等研究表明從被毛毛囊細胞中提取DNA的最大缺點是獲得的DNA量非常少，如操作不慎，就有可能提取不到DNA[5]。毛干相對于毛囊，其DNA含量更少，幾乎所有成分都是角蛋白，但作為動物組織，毛干具有細胞結構，如果提取方法得當仍可以獲得一定量的DNA[6]。吳云良通過對細胞的煮沸和冷卻，使細胞破裂、蛋白質變性，從而獲得用于PCR擴增的模板DNA的法為提取東北虎毛發中DNA[7]。徐懷亮等提出一種快捷、簡便、經濟、高效、安全、有效的提取藏酋猴毛干中DNA的方法——納米磁珠法，并指出進行毛發取樣時以5～10根較為合適[8]。目前，國內從動物毛皮中提取DNA的方法，主要采用經典的DNA提取技術：蛋白酶K法裂解結合酚-氯仿抽提[9];研究對象主要是一些珍稀動物如小熊貓[10]、鬣羚[11]、麝科動物[12]、揚子鱷[13]等的陳舊毛皮標本。雖然有關毛干DNA提取的報道已屢見不鮮，但由于毛干DNA含量低、髓質層與皮質層中含大量色素不易與DNA分離而抑制PCR擴增等問題[14-15]，常造成DNA提取、純化困難，導致分子生物學相關研究受到限制，影響下游工作。關于山羊絨DNA提取方面的報道較少，本文對山羊絨DNA提取方法進行了試驗與研究，采用PCR擴增的手段對方法的可靠性進行驗證。

1 ? ?試驗材料與儀器

1.1 ?試劑

試驗用水應符合GB/T ?6682中一級水的規格，組織和毛發提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（TaKaRa Code.9765），Premix Ex Taq? （Probe qPCR） （TaKaRa Code. RR390A），100%乙醇，DNA Laddar Marker。

1.2 ?儀器與設備

冰箱：4℃～20℃，天平：感量0.0001g，分析研磨機，剪刀，恒溫水浴鍋，離心機（12000 rpm），渦旋混合器，微量可調移液器：0.1μL～2.5μL，1μL～10μL，2μL～20μL，10μL～100μL，20μL～200μL，100μL～1000μL，1.5mL離心管，超凈工作臺，PCR儀，實時熒光定量PCR儀，電泳裝置，凝膠成像儀。

2 ? ?試驗方法與步驟

2.1 ?取樣

從山羊絨制品的不用部位取樣，共取約1 g試樣。

2.2 ?制樣

用剪刀將樣品剪碎，經分析研磨機打散混勻，再用剪刀盡量剪碎至2 mm以下，再次用分析研磨機混勻。

2.3 ?DNA的提取

從混勻的樣品中稱取約5 mg試樣，放入2 mL離心管中，每個樣平行提取兩管，提取步驟嚴格按照試劑盒說明書進行操作，此處不贅述。提取過程注意如殘存纖維狀組織無法完全裂解，裂解之后先12000 rpm離心2分鐘，去除雜質之后再進行后續操作。提取試劑盒由寶生物工程（大連）有限公司提供，試劑盒型號TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0。

2.4 ?引物探針信息

本文所用的引物和探針均由TakaRa寶生物工程（大連）有限公司合成，具體見表1。

表1 ? ?山羊絨成分熒光定量PCR引物及探針

3 ? ?結果與分析

3.1 ?DNA提取效果

DNA提取結束后對其進行DNA電泳以確保其DNA的提出，具體結果見圖1。 由圖1可見，提取的DNA擴增條帶清晰，提取效果良好。

圖1 ? ?提取山羊絨DNA電泳圖

2μLApplied，1%Agarose;M：DNA Marker λ-Hind III digest;1-2：山羊絨DNA

3.2 ?引物特異性驗證

在優化好的PCR反應條件和反應體系下，以鴨絨、鵝絨、綿羊毛、兔毛、山羊絨、牦牛絨、羊駝毛的DNA為特異性試驗對照進行PCR檢測。電泳結果顯示，僅有山羊絨被擴增出條帶，而陰性對照未擴增出條帶，證明山羊絨引物的特異性良好，將其應用于PCR方法，山羊絨成分可以從其他纖維中有效地鑒別出來，具體結果見圖2。圖2所顯示的擴增片段大小約是300bp，大小符合所設計的引物片段大小303bp，且陰性對照和其他非山羊絨模板對照均未出現特異性條帶。

1 ? 2 ? ?3 ? 4 ? ?5 ? 6 ? ?7 ? 8 ? M

圖2 ? ?PCR特異性檢測結果

5μL Applied， 3% Agarose，M：100bp DNA Laddar Marker;1：鴨絨PCR產物;2：鵝絨PCR產物;3：綿羊毛PCR產物;4：兔毛PCR產物;5：山羊絨 PCR產物;6：牦牛絨PCR產物;7：羊駝毛PCR產物;8：陰性對照（Negative Control）。

3.3 ?檢測體系及結果

3.3.1 ?反應體系及反應條件

（1） PCR反應體系

以提取的山羊絨DNA為模板，每次反應均設陰性對照和陽性對照。實時熒光PCR反應體系25 μL，具體見表2。

表2 ? ?熒光定量PCR反應體系

注： Negative control反應時，加入RNase free dH2O;Positive反應時，做兩個平行樣。

（2）反應條件

本試驗建立的熒光定量PCR初步反應參數包括預變性、變性、退火延伸三步。實時熒光定量PCR初步反應參數見表3。

表3 ? ?熒光定量反應條件參數

ABI 7500 Fast Real Time System熒光定量PCR儀完全封閉操作，儀器可以直接讀數，熒光定量PCR熒信號在每一循環延伸步驟完成后收集，并立即顯示出結果，可實時觀察每一循環收集熒光信號的強度。

3.3.2 ?檢測結果

（1） Ct值及結果判定

在優化好的熒光PCR反應條件和反應體系下，選擇鴨絨、鵝絨、綿羊毛、兔毛、山羊絨、牦牛絨、羊駝毛的DNA為特異性試驗的對照來進行熒光PCR檢測。檢測結果顯示，僅山羊絨Ct值為26.125，而其他樣品及陰性對照無Ct值，Ct值及結果判定見表4。

（2） 熒光PCR檢測特異性試驗結果

在優化好的熒光PCR反應條件和反應體系下，選擇鴨絨、鵝絨、綿羊毛、兔毛、山羊絨、牦牛絨、羊駝毛的DNA為特異性試驗的對照來進行熒光PCR檢測。檢測結果顯示，僅山羊絨有擴增曲線，而其他對照以及空白對照均沒有擴增曲線，表明本試驗設計的特異性引物和探針與山羊基因具有較高同源性，而與其他常見動物物種的基因并沒有同源性，該檢測方法具較強的特異性。具體結果見圖3。

圖3 ? ?山羊絨DNA熒光PCR結果

4 ? ?結論

本文使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0 試劑盒提取山羊絨DNA，經檢測驗證，DNA擴增曲線良好，電泳條帶清晰，空白對照是陰性結果，引物對在其他幾種動物纖維體系內，包含鴨絨、鵝絨、綿羊毛、兔毛、牦牛絨和羊駝毛，沒有擴增。引物探針反應性能和特異性良好，該試劑盒提取山羊絨纖維DNA可以用于山羊絨檢測。試驗時將纖維樣品盡量處理成粉末狀，并在樣品經裂解液處理后先離心除去其中尚未完全溶解的纖維，然后進行PCR擴增是比較有利的，完全能夠得到滿足PCR擴增要求的DNA樣品。

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（作者單位：遼寧出入境檢驗檢疫局）